1、多倍化是植物進(jìn)化的重要途徑也是促進(jìn)植物發(fā)生改變的重要力量。經(jīng)研究表明三倍體黑楊與二倍體黑楊相比具有生長速度快的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室前期研究證明黑楊三倍化后，其基因組甲基化水平顯著高于二倍體，說明DNA甲基化后對(duì)植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化過程中重要的催化酶，為進(jìn)一步探索三倍體黑楊速生形成的分子機(jī)制，本研究以三倍體和二倍體黑楊為材料，利用同源序列克隆、定量PCR技術(shù)、MSAP甲基化分析技術(shù)，分離了DNA甲基轉(zhuǎn)移

2、酶基因的特異片段，并對(duì)其在2x和3x黑楊之間表達(dá)差異進(jìn)行了分析，試圖從DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因差異表達(dá)角度探究2x與3x速生性狀差異表達(dá)的原因。主要結(jié)果如下：
　　 1．利用同源序列克隆技術(shù)，首次分離出三倍體黑楊中4類(MET、CMT、DRM、DNMT2)8個(gè)特異甲基轉(zhuǎn)移酶片段，經(jīng)Blast比對(duì)，其中5個(gè)片段與二倍體同源性達(dá)到100％，3個(gè)片段發(fā)生了剪切變化。
　　 2．通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測8個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶在不同倍性、不

3、同部位、不同生長時(shí)期間表達(dá)模式的差異。通過對(duì)5個(gè)不同部位基因表達(dá)的檢測，表明不同倍性黑楊在相同的部位可能不同種類的甲基轉(zhuǎn)移酶參與主要的甲基化調(diào)控。通過分析植株從分化早期的莖尖到分化晚期的葉和莖整個(gè)生長過程中基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，MET家族(PnD1和PnD2)基因可能是拮抗調(diào)節(jié)，CMT（PnD3和PnD4）家族基因可能是協(xié)同調(diào)節(jié)。而隸屬于DNMT2家族的PnD6基因在各部位的表達(dá)都比較弱，唯獨(dú)三倍體莖尖有很高的表達(dá)。由于莖尖

4、是生長旺盛的部位，PnD6有可能是影響三倍體速生的重要基因。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PnD4和PnD6兩個(gè)基因在不同倍性之間表達(dá)有明顯的差異。
　　 3．使用電子克隆、cDNA walking和RACE擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合的策略，首次在三倍體黑楊中分離了CMT類和DNMT2類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因全序列，并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)及蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因不但具有甲基轉(zhuǎn)移酶保守的核心催化區(qū)域，同時(shí)還各自具有所屬家族的特征功能區(qū)，尤其是PnD4，其

5、三維結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該基因轉(zhuǎn)錄的蛋白可能具有一個(gè)特異的用于和染色體集合的“鉗子”結(jié)構(gòu)。
　　 4．綜合表達(dá)分析的結(jié)果和cDNA全序列預(yù)測分析，我們推測，三倍體PnD4基因CD結(jié)構(gòu)域的消除并沒有影響該基因在不同倍性間的表達(dá)，CMT家族的不同基因會(huì)在黑楊不同生長時(shí)期主要負(fù)責(zé)調(diào)控甲基化。隸屬于DNMT2家族的PnD6可能在分化旺盛的莖尖時(shí)期大量表達(dá)，用于后期植株的分化生長。
　　 5．利用5氮雜胞苷對(duì)水培環(huán)境下的三倍體黑楊進(jìn)行脅