1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文摘要I摘要摘要DNA甲基化作為真核生物中的一種重要表觀遺傳機(jī)制，在不同物種之間的分布模式和作用差異顯著。在真菌中，DNA甲基化在調(diào)控多種生物過(guò)程中起著重要作用，但是截止到目前真菌有性生長(zhǎng)發(fā)育與DNA甲基化的關(guān)系尚未有研究。蛹蟲(chóng)草以其易于獲得有性階段的特性，為我們研究真菌有性生長(zhǎng)發(fā)育階段的表觀遺傳現(xiàn)象提供了寶貴資源。羅伯茨綠僵菌是研究真菌侵染昆蟲(chóng)機(jī)制的一種模式系統(tǒng)，同時(shí)也是化學(xué)農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑的替代品，但是目前對(duì)其DNA

2、甲基化分子機(jī)制研究甚少。本論文首先通過(guò)克隆測(cè)序、酶活測(cè)定等方法在蛹蟲(chóng)草中鑒定出兩個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（CmDMTA和CmDIM2）。然后利用亞硫酸氫鹽高通量測(cè)序技術(shù)研究蛹蟲(chóng)草有性階段和無(wú)性階段的DNA甲基化模式，并結(jié)合數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)研究DNA甲基化在有性生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。最后，對(duì)羅伯茨綠僵菌中的兩個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MrRID和MrDIM2）進(jìn)行單敲除和雙敲除，以此來(lái)研究綠僵菌中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。具體研究結(jié)果如下：（1）蛹蟲(chóng)草DNA

3、甲基轉(zhuǎn)移酶的研究通過(guò)同源檢索，發(fā)現(xiàn)在蛹蟲(chóng)草中存在兩個(gè)發(fā)生DNA甲基化所必需的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（CmDMTA和CmDIM2）。通過(guò)RACE及測(cè)序方法得到了CmDMTA和CmDIM2基因的全長(zhǎng)序列，并且進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。隨后，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE結(jié)果顯示，兩個(gè)重組蛋白都被成功的誘導(dǎo)表達(dá)，而且Westernblot結(jié)果顯示重組蛋白都能夠被抗HIS標(biāo)簽抗體特異性識(shí)別。然后采用鎳柱純化重組蛋白，

4、獲得高純度重組蛋白。最后通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CmDMTA和CmDIM2都具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。（2）DNA甲基化在蛹蟲(chóng)草有性生長(zhǎng)發(fā)育中的作用①DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在蛹蟲(chóng)草不同階段的表達(dá):RealtimePCR結(jié)果顯示CmDMTA和CmDIM2在蛹蟲(chóng)草不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)變化趨勢(shì)相似。隨著分生孢子的不斷產(chǎn)生，CmDMTA和CmDIM2基因的表達(dá)量越來(lái)越高，CmDMTA和CmDIM2基因的表達(dá)量在有性階段的初期達(dá)到最高。②蛹蟲(chóng)草不