1、目的：
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高居各種惡性腫瘤第三位，在腫瘤致死的病因中居第四位。2008年全球新增癌癥患者1270萬人，其中絕大部分發(fā)生在發(fā)展中國家。結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期檢測和治療方法。近年來隨著表觀遺傳學(xué)的興起，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化不僅參與體內(nèi)多種重要的生理過程，而且在眾多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用，被公認(rèn)為是腫瘤常

2、見的表觀遺傳學(xué)改變之一。介于腫瘤相關(guān)的甲基化事件有望成為結(jié)直腸癌防治中的重要分子靶標(biāo)，因此，深入探討DNA甲基化與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于尋求結(jié)直腸癌的臨床早期診斷、治療和預(yù)防的新途徑都具有重要的指導(dǎo)意義。
　　基于上述研究現(xiàn)狀，本研究擬從DNMT1切入，首先檢測DNMT1和T-cadherin蛋白在人結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)情況，分析結(jié)直腸癌及癌旁組織中DNMT1和T-cadherin蛋白表達(dá)水平與臨床和病理的

3、相關(guān)性。進(jìn)一步在基因水平上探討人結(jié)直腸癌組織中DNMT1mRNA的表達(dá)和T-cadherin的甲基化狀況，分析其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。接著用技術(shù)，檢測DNMT1siRNA干擾對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株DNMT酶活性的作用，明確DNMT1siRNA對(duì)結(jié)直腸癌DNA甲基化水平的影響。最后探討DNMT1siRNA靶向性沉默DNMT1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響，明確DNM

4、T1siRNA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡影響的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.收集2009年10月到2011年1月湘雅二醫(yī)院手術(shù)切除的36例結(jié)直腸癌患者的結(jié)直腸癌組織和相應(yīng)的癌旁組織，同時(shí)收集患者臨床資料，所有病例確診為腺癌。采用鏈霉素抗生物素-過氧化酶(SP)免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌和相應(yīng)癌旁組織中DNMT1和T-cadherin蛋白表達(dá)，DNMT1在細(xì)胞核染色判定為陽性，T-cadherin在細(xì)胞膜染色判定為陽性。每張切片在高倍

5、鏡視野下，隨機(jī)計(jì)數(shù)至少500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分率。
　　2.RT-PCR檢測DNMT1基因mRNA表達(dá)情況，利用甲基化特異性PCR方法檢測T-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況，分析結(jié)直腸癌中DNMT1mRNA的表達(dá)與T-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化狀況及兩者之間的相關(guān)性。
　　3.采用脂質(zhì)體法DNMT1siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性siRNA（15nM）組、陰

6、性siRNA(31nM)組、DNMT1siRNA（15nM）組、、DNMT1siRNA(30nM)組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)候收集細(xì)胞，分別提取DNA、總RNA和蛋白質(zhì)（共5組），RT-PCR檢測DNMT1基因mRNA的表達(dá)情況，WB檢測DNMT1蛋白的表達(dá)情況，DNMT酶活性檢測試劑盒檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染對(duì)酶活性的影響。
　　4.采用脂質(zhì)體法DNMT1siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、陰性siRNA（15nM）組、陰性

7、siRNA(31nM)組、DNMT1siRNA（15nM）組、、DNMT1siRNA（30nM）組，轉(zhuǎn)染48小時(shí)收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)候，MTT法測定各組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況，流式檢測細(xì)胞周期和凋亡情況，采用RT-PCR檢測DNMT1siRNA干擾對(duì)基因CDNK1A、T-cadherin、Bcl-2和Bax的mRNA水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化研究顯示，T-cadherin分子的表達(dá)位于細(xì)胞膜，呈棕黃色。閱片結(jié)

8、果顯示T-cadherin在結(jié)直腸癌組織及非癌性結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為38.89％(14/36)、100％(36/36)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DNMT1分子的表達(dá)位于細(xì)胞核，亦呈棕黃色。閱片結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率69.44％(25/36)，高于非癌性結(jié)直腸癌組織11.11％(4/36)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。T-cadherin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小

9、無關(guān)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1-1），但其與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期有關(guān)，且分別與腫瘤的分化程度和Dukes分期呈負(fù)相關(guān)。DNMT1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無關(guān)，組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，表1-2)，但其與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，且與Dukes分期呈正相關(guān)。
　　2.結(jié)直腸癌組織DNMT1mRNA的2-△△ct均值為2.72±0

10、.48，癌旁組織的2-△△ct均值為1.44±0.49，前者明顯高于后者(P＜0.05)。結(jié)直腸癌組織的甲基化比例高達(dá)73.73％±31.24％，癌旁組織的甲基化比例為44.25％±28.01％，前者明顯高于后者，(P＜0.05)。結(jié)直腸癌組織中的DNMT1mRNA表達(dá)量與T-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化構(gòu)成比呈正相關(guān)(rs=0.875，P=0.001)。
　　3.瞬時(shí)干擾后，Western blot結(jié)果顯示DNMT1siRN

11、A（15nM）組和DNMT1siRNA(30nM)組的DNMT1蛋白表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組、陰性siRNA（15nM）組和陰性siRNA（30nM）組，且以DNMT1siRNA（30nM）組最低。4組中實(shí)驗(yàn)組的DNMT酶活性的抑制率均高于空白對(duì)照組(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組的抑制率分別高于陰性siRNA(15nM)組和陰性siRNA(30nM)組(P＜0.05)，且以DN

12、MT1siRNA(30nM)組最高。RT-PCR結(jié)果顯示DNMT1siRNA（15nM）組和DNMT1siRNA（30nM）組的DNMT1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白對(duì)照組(P＜0.05)，且分別低于陰性siRNA（15nM）組和陰性siRNA（30nM）組(P＜0.05)，DNMT1siRNA(30nM)組更低于DNMT1siRNA(15nM)組。
　　4.WST-8法檢測顯示DNMT1siRNA干擾48h， DNMT1siR

13、NA(15nM)組的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞存活率低于陰性siRNA(15nM)組(P＜0.05); DNMT1siRNA(30nM)組的存活率低于陰性siRNA(30nM)組(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)組的存活率低于DNMT1siRNA(15nM)組(P＜0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率最低(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)組高于陰性siRNA(15nM)組(P＜0.05

14、);DNMT1siRNA(30nM)組高于陰性siRNA(30nM)組(P＜0.05);DNMT1siRNA(30nM)組高于DNMT1siRNA(15nM)組(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀分析DNA細(xì)胞周期，各組G0/G1期所占比例最高，各實(shí)驗(yàn)組均高于空白對(duì)照組，DNMT1siRNA(30nM)組和DNMT1siRNA(15nM)組(P＜0.05)明顯高于各自的陰性對(duì)照組(P＜0.05);而各實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞所占比例低于空白對(duì)照，DNMT

15、1siRNA(15nM)組的S期細(xì)胞所占比例明顯低于陰性siRNA(15nM)組(P＜0.05); DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組的G2/M期細(xì)胞比例明顯低于空白組和各組的陰性對(duì)照組(P＜0.05)。RT-PCR檢測Bcl-2、Bax、T-cadherin和CDNK1A mRNA表達(dá)量，干擾試驗(yàn)陰陽性組的Bcl-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，DNMT1siRNA(30nM)組低于陰性s

16、iRNA(30nM)組;干擾試驗(yàn)陰陽性組的Bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，其中DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組高于各自的陰性對(duì)照組，且在這兩組內(nèi)Bax mRNA增加的比例遠(yuǎn)大于Bcl-2 mRNA增加的比例;干擾試驗(yàn)陰陽性組的T-cadherin mRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組高于各自的陰性對(duì)照組，且DNMT

17、1siRNA(30nM)組最高;干擾試驗(yàn)陰陽性組的CDNK1AmRNA的相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組，DNMT1siRNA(15nM)組和DNMT1siRNA(30nM)組高于各自的陰性對(duì)照組，且以DNMT1siRNA(30nM)組為最高。以上比較均基于有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.T-cadherin蛋白的表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)相對(duì)較低，而DNMT1蛋白的表達(dá)則相對(duì)較高，且二者都與一些臨床參數(shù)密切相關(guān)

18、，這將有利于指導(dǎo)臨床分期和評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后。但DNMT1蛋白有使基因甲基化的生物學(xué)功能，T-cadherin蛋白的表達(dá)過程是否會(huì)受到此影響，二者在不同組織中表達(dá)量變化的具體機(jī)制是什么，需要我們進(jìn)一步研究。
　　2.結(jié)直腸癌組織中T-cadherin下調(diào)機(jī)制和啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)。DNMT1mRNA的高表達(dá)是導(dǎo)致T-cadherin基因啟動(dòng)子甲基化的重要原因，也是結(jié)直腸癌惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制之一。
　　3.DNMT1siRNA干擾可以從

19、mRNA水平影響DNMT1蛋白表達(dá)和DNMT酶活性，且三者改變呈一致性。
　　4.DNMT1siRNA干擾在細(xì)胞增殖和凋亡兩方面均起到了抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用;用RNA干擾抑制DNMT分子的活性，可以引起與腫瘤細(xì)胞周期和增殖、凋亡相關(guān)的調(diào)控基因mRNA的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，并影響細(xì)胞周期。
　　我們的研究表明:DNMT1對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中有重要影響。多種結(jié)直腸癌相關(guān)基因的甲基化與DNMT1活性密切