1、蘇云金芽胞桿菌(簡稱Bt)是世界上應用范圍最廣的殺蟲微生物,其殺蟲活性主要來源于芽胞形成過程中產(chǎn)生的殺蟲蛋白,對研究殺蟲蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面的研究是當前的一個比較熱門的話題。蘇云金芽胞桿菌表達的CrylAc蛋白是就目前來說是對鱗翅目昆蟲的毒性最高,并且研究最多的Bt蛋白之一,不僅在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、森林管理上,在蚊蟲控制及水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中也具有較為廣泛的應用,但是CrylAc蛋白結(jié)構(gòu)與功能的相關性并未完全明確,所以需要運用基因突變技術(shù)來進行較為深

2、入的闡釋。本論文使用易錯PCR方法對蘇云金芽胞桿菌crylAc基因進行突變,從突變菌株中篩選并得到了對棉鈴蟲殺蟲毒力提高的突變株,通過對突變前后CrylAc蛋白理化性質(zhì)的改變從而得到了蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學證據(jù)。
　　 選擇了不同Mg2+和Mn2+濃度進行易錯PCR實驗,通過對突變基因的測序得到最適的PCR條件以擴增crylAc基因。之后,將其連接至帶有Bt啟動子和終止子的pHT315質(zhì)粒上構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHT315ptAc

3、。將該質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10感受態(tài)后使用了快速裂解的方法鑒定轉(zhuǎn)化子。然后,挑取多個陽性轉(zhuǎn)化子接種至同一培養(yǎng)基中,提取其質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至Cry-B感受態(tài)細胞中。在對突變菌株進行初篩、復篩等進行各項鑒定后,得到了一些突變株。對該突變株進行生物活性測定,并對統(tǒng)計結(jié)果進行分析后得到了突變株2-23,該突變株對棉鈴蟲的殺蟲毒力較野生株有了明顯地提高。
　　 在對突變株2-23 CrylAc蛋白進行鏡檢和SDS—PAGE分析后,發(fā)現(xiàn)其與

4、野生株相比在顯微形態(tài)學和SDS—PAGE檢測結(jié)果上區(qū)別并不大。但對其生測的結(jié)果表明突變株2-23產(chǎn)生的蛋白對棉鈴蟲的毒力較野生株有明顯的提高。在提取突變株2-23的pHT315ptAc質(zhì)粒并對其進行DNA測序后發(fā)現(xiàn)突變株2-23 crylAc基因的第497位發(fā)生了基因突變,使CrylAc蛋白第166位的氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸。經(jīng)過分析得知該位點的突變提高了α5螺旋整體的疏水性,使α5螺旋在與受體結(jié)合時更有利于與疏水脂質(zhì)界面相結(jié)合,