1、幾丁質(zhì)是自然界儲量第二的天然高聚物，幾丁質(zhì)酶是降解其的主要酶類。Bt是應(yīng)用最成功的殺蟲微生物，幾丁質(zhì)酶對Bt殺蟲有增效作用。本研究以篩選到的具有較高幾丁質(zhì)水解能力的Bt菌株BRC-Bt1為試驗材料，克隆表達(dá)該菌株的2個幾丁質(zhì)酶基因，對這2種幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域組成、催化反應(yīng)機(jī)制、表達(dá)調(diào)控以及水解產(chǎn)物的生物活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　 BRC-Bt1菌株的chi74基因和目前已發(fā)現(xiàn)的Bt70kDa幾丁質(zhì)酶在核酸序列上高度同源，該酶屬18

2、家族幾丁質(zhì)酶，由信號肽、催化區(qū)、FN3和ChBD等4個結(jié)構(gòu)域組成，理論分子量74kDa，pI5.77。chi74基因和GST融合在E.coli表達(dá)產(chǎn)物為胞內(nèi)可溶性蛋白，含chi74基因的E.coli細(xì)胞能在膠體幾丁質(zhì)平板產(chǎn)生水解圈。以膠體幾丁質(zhì)為底物，Chi74蛋白最適反應(yīng)溫度60℃、pH5，在20-80℃和pH4-8都有活性。Na+、K+、NO3-、Cl-不影響該酶活性；Mg2+和SO42-對該酶有激活作用，其中6mmol/L濃度Mg

3、2+提高酶活力約40％，而SO42-在0-3mmol/L濃度范圍能提高酶活性，3mmol/L時，提高酶活力約20％，之后再增加濃度激活作用反而下降；Cu2+、Ag+都抑制酶活性。HPLC分析水解產(chǎn)物表明該酶能水解膠體幾丁質(zhì)形成GlcNAc、幾丁二糖以及聚合度更高的幾丁寡糖，隨著反應(yīng)時間的延長，GlcNAc占產(chǎn)物的比例不斷提高。該酶為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶。
　　 構(gòu)建chi74基因不同截短酶基因chiA、chiAF、chiAC，三個截短基

4、因編碼的蛋白產(chǎn)物理論分子量和pI分別為：54kDa、6.04，63kDa、6.07和66kDa、5.74。三個截短基因GST融合在E.coli細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物ChiA、ChiAF、ChiAC水解膠體幾丁質(zhì)的活性分別是野生酶的81％、72％、39％。3種截短酶最適反應(yīng)溫度都是60℃，且溫度變化對酶活性的影響和Chi74類似。Mg2+能激活3種截短酶，且激活效率比Chi74高，6.0mmol/L，的Mg2+對ChiA、ChiAF、ChiAC分別

5、提高酶活力85％、62％、60％。低濃度的Ag+對3種截短酶活性抑制也比野生酶顯著，500μmol/L，的Ag+對ChiAC、ChiAF、ChiA等3種截短酶活力分別為70.0％、63.2％、55.0％。截短酶的水解產(chǎn)物HPLC結(jié)果表明，Chi74的C端不同片段缺失，膠體幾丁質(zhì)水解不徹底，產(chǎn)物中GlcNAc含量不高，而幾丁寡糖含量高。截短酶與Chi74催化活性的差異，表明FN3和ChBD對Chi74水解膠體幾丁質(zhì)很重要。
　　

6、克隆chi36基因，推導(dǎo)蛋白分子量40kDa，pI6.52。該基因與Bt、Bc、Ba上發(fā)現(xiàn)的編碼36kDa大小的幾丁質(zhì)酶基因同源性很高，而與chi74沒有同源性。該酶也屬于18家族幾丁質(zhì)酶，只有信號肽和催化區(qū)。chi36基因和GST融合表達(dá)產(chǎn)物，以膠體幾丁質(zhì)為底物，最適合反應(yīng)溫度55℃、pH5，在30-80℃、pH4-8都有活性。Na+、K+、Mg2+、NO3-、Cl-對該酶活性基本沒有影響；低濃度的SO42-對該酶有激活作用；Cu2+

7、、Fe3+、Ag+則抑制該酶活性。Chi36水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物HPLC結(jié)果表明：該酶是內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，產(chǎn)物中GlcNAc含量低，多種幾丁寡糖含量較高。從水解產(chǎn)物可以看出，Chi36水解膠體幾丁質(zhì)的機(jī)制和Chi74不同，而且Chi36水解的效率也不如Chi74。等體積混合Chi36和Chi74，催化活性協(xié)同提高。
　　 用來自chi74的3個C端片段(ChBD、FN3、ChBD+FN3)添加到chi36基因的C端構(gòu)建3種加長酶基因c

8、hi36F、chi36C、chi36FC，預(yù)測分子量分別為49kDa、52kDa、60kDa。加長酶基因和GST融合表達(dá)產(chǎn)物Chi36F、Chi36C、Chi36FC幾丁質(zhì)酶活性分別比野生Chi36提高7％、21％、33％，最適合反應(yīng)溫度仍是55℃。Ag+對3種加長酶活性抑制率比Chi36低，500μmol/L時，Chi36F、Chi36C、ChiFC加長酶活力分別保留為64.0％、66.0％、70.5％。加長酶水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物組成與

9、Chi36類似，且產(chǎn)物中各個組分的濃度都提高，表明加長酶對底物的親和力增強(qiáng)，進(jìn)一步說明ChBD、FN3在催化反應(yīng)中發(fā)揮作用，且ChBD比FN3更重要。
　　 分別克隆6株Bt菌株chi74和chi36基因上游序列，序列功能分析結(jié)果表明，這兩個基因都是獨(dú)立表達(dá)的，且兩個基因在Bt基因組距離很遠(yuǎn)。兩個基因上游的啟動子沒有同源性，表明Bt的兩個幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)調(diào)控方式不同。chi74和chi36基因啟動子分析結(jié)果表明：chi74基因

10、上游有多個潛在啟動子，且不同菌株這些啟動子的同源性較高，而在chi36上游發(fā)現(xiàn)的啟動子較少，且菌株間的差異較大。6個菌株都在基因上游發(fā)現(xiàn)CAP/CRP位點、NIT-2等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)的BRC-Bt1菌株發(fā)酵液上清對香蕉炭疽菌生長有抑制作用，且產(chǎn)酶培養(yǎng)基上清的抑制率更高，抑制率分別為42.8％、27.4％。產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵的上清還能抑制稻瘟病菌絲生長和孢子萌發(fā)。E.coli表達(dá)的Chi74和

11、Chi36蛋白混合，分別以濃度10mg/mL和5mg/mL作用于松材線蟲，24h死亡率分別為87.5％、54.5％。以膠體幾丁質(zhì)為底物，混合酶解反應(yīng)不同時間的產(chǎn)物對松材線蟲的致死情況差異較大，其中酶解8h的產(chǎn)物對松材線蟲的毒殺作用最好，平均死亡率為100％。1h、3h的水解產(chǎn)物處理松材線蟲的死亡率分別為23.8％、69.3％，而處理時間長達(dá)24h的產(chǎn)物對線蟲幾乎沒有毒殺作用，致死率僅為8.4％。此外，酶解產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞SMMC-7721