1、背景：
　　移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是造血干細(xì)胞移植后是影響患者總生存率和生存質(zhì)量的主要因素。激素是治療急性和慢性 GVHD的一線(xiàn)用藥，然而50％患者因?qū)に刂委煙o(wú)反應(yīng)而需要二線(xiàn)藥物治療，但由于二線(xiàn)藥物缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不僅導(dǎo)致治療效果不確定而且藥物相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率較高。此外，部分慢性 GVHD患者存在激素依賴(lài)，而長(zhǎng)期應(yīng)用激素引起的感染、高血糖癥、高血壓、骨質(zhì)疏松癥和消化系統(tǒng)疾病

2、等，影響著患者的生存質(zhì)量。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BMSC）具有低免疫原性、多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)特性以及遷移到受損傷組織促進(jìn)組織修復(fù)等特征備受關(guān)注，研究顯示輸注BMSC對(duì)激素抵抗型GVHD是有效的，且未發(fā)現(xiàn)輸注相關(guān)不良反應(yīng)。
　　骨髓造血微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持依賴(lài)于骨髓細(xì)胞間頻繁的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而以間隙連接蛋白43(connexin43, CX43）為基礎(chǔ)的間

3、隙連接細(xì)胞通訊(gap junction intercellular communication, GJIC)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞間普遍存在的直接通訊方式。骨髓基質(zhì)細(xì)胞CX43表達(dá)的缺陷會(huì)影響造血干細(xì)胞的植入及化療后造血的恢復(fù)。而白血病造血調(diào)控異常極有可能與白血病骨髓基質(zhì)細(xì)胞 CX43表達(dá)的降低或缺失、GJIC功能下降有關(guān)。
　　鑒于此，我們?cè)O(shè)想通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CX43基因的BMSC體系，力圖為深入探索在GVHD中，CX43基因修飾的B

4、MSC是否會(huì)通過(guò)增加BMSC間及BMSC與骨髓其他細(xì)胞間的信息通訊更好的發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用提供理論及實(shí)驗(yàn)的證據(jù)。
　　目的：
　　建立小鼠BMSC體外培養(yǎng)體系，構(gòu)建CX43基因過(guò)表達(dá)的重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染小鼠BMSC。以期為探討CX43基因修飾的小鼠BMSC在GVHD中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.采用全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法獲取小鼠BMSC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，行成骨、成脂、成內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化并分別用

5、茜素紅染色、油紅染色和免疫熒光及成小管特性鑒定。
　　2.采用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI/XbaI雙酶切含目的基因的質(zhì)粒和慢病毒載體，再用DNA連接酶將目的基因與線(xiàn)性化的慢病毒載體進(jìn)行連接，獲得重組慢病毒載體，先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，再對(duì)其測(cè)序分析，將測(cè)序正確的載體和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，收集、濃縮病毒液后用孔稀釋法測(cè)定其滴度，并采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)CX43基因表達(dá)進(jìn)行鑒定。然后用重組慢病毒pHBLVTM-CX

6、43-GFP、pHBLVTM–GFP感染BMSC，最后采用免疫細(xì)胞熒光技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)法和Western blot方法檢測(cè)感染前后 CX43蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)細(xì)胞流式鑒定示BMSC表達(dá)CD73、CD44、CD29、CD90，不表達(dá)CD34、CD105；成骨誘導(dǎo)分化結(jié)束后茜素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)分化后倒置顯微鏡下可見(jiàn)明顯脂滴經(jīng)油紅染色呈陽(yáng)性；成內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化后經(jīng)免疫熒光檢測(cè)示內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)識(shí) CD3

7、1、CD34表達(dá)明顯增加，將細(xì)胞接種于 Matrigel基底膠上有小管形成。
　　2.瓊脂糖凝膠電泳鑒定和測(cè)序分析均證明 CX43慢病毒載體構(gòu)建成功，測(cè)定濃縮后病毒滴度為1×108/mL，實(shí)時(shí)定量PCR鑒定CX43基因在293FT細(xì)胞的表達(dá)明顯增加；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法、免疫細(xì)胞熒光技術(shù)和Western blot方法測(cè)定BMSC的CX43蛋白的表達(dá)，結(jié)果均顯示pHBLVTM-CX43-GFP轉(zhuǎn)染組的CX43蛋白表達(dá)高于對(duì)照組（P<0