1、研究背景：肺癌是危害人類健康的最常見腫瘤之一，高居惡性腫瘤的首位，近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率都呈急劇上升的趨勢。非小細(xì)胞肺癌(no small cell carcinoma，NSCLC)占所有肺惡性腫瘤的80％，其中腺癌(adenocarcinoma，ADC)占NSCLC的60％，因此肺腺癌是NSCLC最常見的病理組織學(xué)類型。肺癌的傳統(tǒng)治療以手術(shù)切除輔以放化療為主，近十年來分子靶向治療在改善NSCLC特別是肺腺癌患者預(yù)后方面取得了

2、巨大的進(jìn)展，有效的延長了患者的生存時間。但是，即使治療的手段不斷進(jìn)步，肺腺癌患者的5年總生存率仍低于30％，即使是肺腺癌Ⅰ期的完整切除腫瘤的患者，腫瘤的復(fù)發(fā)仍占有很大的比例（約30％）;而大多數(shù)肺腺癌患者在確診時即為晚期，因此傳統(tǒng)化療在晚期肺腺癌患者的治療策略中占有主導(dǎo)地位。部分肺腺癌患者對放化療甚至靶向藥物產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象，尤其是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)表型的出現(xiàn)依然仍是患者化療失敗和預(yù)后不良的重要分

3、子事件之一。因此，尋找促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展的新的分子機制，明確新的分子靶點和逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥的方法是預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和改善肺腺癌預(yù)后的有益探索。
　　肺癌的發(fā)生發(fā)展和耐藥發(fā)生機制復(fù)雜，涉及到多種抑癌基因和癌基因的表達(dá)失調(diào)。目前，細(xì)胞信號傳到通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及腫瘤耐藥的關(guān)系成為肺癌研究的新亮點。其中PTEN-PI3K/Akt細(xì)胞信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，多種生長因子激活通路中的關(guān)鍵蛋白活化PI3K，使Akt磷酸化激活下游

4、的多種靶基因，如BAD、mTOR、FKHR、GSK3β和MDM2等，從而促進(jìn)細(xì)胞存活、生長、增殖和惡性轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程和表型，與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后關(guān)系密切。抑癌基因PTEN(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)是這一通路的抑制分子，能通過使第二信使PIP3脫磷酸化為PIP2，拮抗PI3K/Akt細(xì)胞信號通路信號傳遞過程而發(fā)揮其抑癌作用。在肺腺癌中，

5、PTEN的失表達(dá)率可達(dá)30～50％，是肺腺癌發(fā)生早期最常見的分子事件，失活機制除了基因突變和缺失之外，翻譯后修飾可能也是其失活的重要機制。PTEN的泛素化是其在胞質(zhì)泛素-蛋白酶體系中降解和影響蛋白穩(wěn)定性的主要翻譯后修飾過程，這一過程的增強可能是PTEN缺失表達(dá)的機制之一。由于PTEN-PI3K/Akt通路在諸多信號傳導(dǎo)途徑中的中心地位備受關(guān)注，目前認(rèn)為，肺腺癌細(xì)胞中PTEN失活介導(dǎo)PI3K/Akt信號通路活化，是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化

6、和化療耐受的重要機制，這一通路異常還與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。
　　NEDD4-1(Neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated4，NEDD4-1)是NEDD家族成員之一，是一種E3泛素化連接酶，可通過其協(xié)同蛋白Ndfip1等共同作用下使PTEN發(fā)生泛素化，多泛素化促進(jìn)PTEN在胞質(zhì)中的降解，單泛素化可發(fā)生細(xì)胞核轉(zhuǎn)入，從而調(diào)控PTEN的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定

7、位，因此NEDD4-1介導(dǎo)的泛素化可能是調(diào)控PTEN的翻譯后修飾的主要機制。多項研究證實，NEDD4-1的高表達(dá)和PTEN的表達(dá)缺失存在于大多數(shù)人類惡性實體腫瘤組織中，并與腫瘤的進(jìn)展和化療敏感性密切相關(guān)。新近研究發(fā)現(xiàn)NEDD4-1是某些惡性腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌等患者的獨立的預(yù)后因子。但是，NEDD4-1在肺腺癌中的表達(dá)和預(yù)后意義尚未可知，參與調(diào)控PTEN的表達(dá)以及對化療耐受的關(guān)系和機制的研究鮮見報道。
　　研究目的：研究泛素化

8、E3連接酶NEDD4-1在肺腺癌組織中的表達(dá)，及其與浸潤轉(zhuǎn)移和化療敏感性等多種臨床病理因素之間的相關(guān)性，并初步探討其提示肺腺癌患者預(yù)后的價值。采用肺腺癌細(xì)胞株A549和耐藥細(xì)胞A549/DDP細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染特異性siRNA沉默NEDD4-1的表達(dá)，探討對肺腺癌敏感細(xì)胞A549和多藥耐藥細(xì)胞A549/DDP的生長、凋亡、浸潤遷移能力、EMT表型以及對化療藥物的敏感性的影響;初步分析NEDD4-1沉默對PTEN-PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路

9、的活性的調(diào)控作用和機制;探討NEDD4-1沉默對耐藥蛋白P-糖蛋白、LRP和MRP等的耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響;研究對NF-κb和AP-1等細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在此調(diào)控過程中的影響;為肺腺癌的靶向性基因治療和耐藥逆轉(zhuǎn)提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　研究方法：采用免疫組織化學(xué)的方法回顧性分析研究了135例肺腺癌組織及對應(yīng)癌旁組織中NEDD4-1、PTEN和p-Akt的表達(dá)，同時采用Western Blot和RT-PCR的方法研究了20例新鮮肺腺癌

10、組織中的表達(dá)，分析蛋白之間的相互表達(dá)關(guān)系及與各臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系和臨床意義。培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和耐藥細(xì)胞A549/DDP，轉(zhuǎn)染NEDD4-1的siRNA進(jìn)行蛋白沉默，采用MTS方法檢測細(xì)胞生存活性和對順鉑和紫杉醇等化療藥物的敏感性，Transwell小室和瓊脂糖實驗檢測細(xì)胞干預(yù)前后遷移和浸潤能力的改變，采用流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞凋亡，實時定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siNEDD4-1沉默效率和靶基因mRNA水平的表達(dá)，Western

11、 blot檢測沉默前后細(xì)胞內(nèi)NEDD4-1、PTEN、p-Akt和NF-kB的表達(dá)分析對PTEN-PI3K/Akt細(xì)胞信號通路分子的影響。
　　研究結(jié)果：1.NEDD4-1在肺腺癌組織中呈顯著高表達(dá)狀態(tài)，而在周圍肺腫瘤肺組織中呈弱表達(dá)或陰性表達(dá)(P＜0.01)。分析結(jié)果顯示，NEDD4-1高表達(dá)與患者的肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期和化療耐受等臨床病理因素密切相關(guān)(P分別＜0.05)，而與其他多種臨床病理學(xué)因素均不相關(guān)。
　

12、　2.SiRNA介導(dǎo)的NEDD4-1沉默誘導(dǎo)肺腺癌敏感細(xì)胞A549細(xì)胞生長抑制，抑制率為42.97±3.04％;促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡;Transwell小室檢測顯示siNEDD4-1導(dǎo)致A549細(xì)胞的浸潤和遷移能力明顯下降;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)NEDD4-1沉默增加了A549細(xì)胞質(zhì)中PTEN的表達(dá)水平，同時激光共聚焦檢測實驗結(jié)果顯示沉默后胞漿內(nèi)PTEN和細(xì)胞核內(nèi)PTEN熒光信號較對照組均有不同程度增強，而免疫沉淀顯示PTEN泛素

13、化水平降低。NEDD4-1沉默后細(xì)胞內(nèi)p-Akt的活化程度降低，從而阻斷了PI3K/Akt細(xì)胞信號通路的活性，并調(diào)控其下游的多種靶蛋白的表達(dá)，如檢測凋亡蛋白BAD表達(dá)升高，mTOR磷酸化水平降低，細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB p65蛋白表達(dá)降低。
　　研究結(jié)論：1.肺腺癌中NEDD4-1和p-Akt表達(dá)較周圍肺組織明顯上調(diào)，而PTEN表達(dá)缺失，三者均與肺腺癌的腫瘤進(jìn)展和化療耐受相關(guān)，多因素分析顯示NEDD4-1高表達(dá)和PTEN低表達(dá)均

14、與肺腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。本結(jié)果提示NEDD4-1表達(dá)上調(diào)可能是肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的常見分子事件，其高表達(dá)可能與肺腺癌患者的耐藥表型出現(xiàn)密切相關(guān)，可能是預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的因子之一。
　　2.SiNEDD4-1對肺腺癌NEDD4-1的沉默能有效的降低A549細(xì)胞內(nèi)NEDD4-1的表達(dá)，抑制肺腺癌細(xì)胞A549的生長，增加細(xì)胞凋亡，細(xì)胞的浸潤和遷移能力都明顯降低，提示NEDD4-1表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞生長存活和的浸潤轉(zhuǎn)移過程，與

15、腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后相關(guān)。NEDD4-1可能是促進(jìn)細(xì)胞惡性表型的一種原癌基因。
　　3.SiNEDD4-1對肺腺癌細(xì)胞NEDD4-1沉默后，細(xì)胞質(zhì)PTEN表達(dá)增加而泛素化水平下降，并見在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中聚集量增加，這能有效下調(diào)磷酸化p-Akt水平，提示NEDD4-1介導(dǎo)的PTEN泛素化通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用。此外，其下游靶蛋白BAD表達(dá)上調(diào)，磷酸化mTOR下調(diào)以及細(xì)胞錄因子NF-Kb p65亞單位表達(dá)表達(dá)水平下降

16、，均提示NEDD4-1表達(dá)上調(diào)通過泛素化過程拮抗PTEN的抗癌作用，活化PI3K/Akt細(xì)胞信號通路及其下游靶蛋白來誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞生長存活和出現(xiàn)化療耐受表型。
　　4.SiNEDD4-1對肺腺癌細(xì)胞NEDD4-1轉(zhuǎn)染沉默后，A549/DDP細(xì)胞對順鉑和紫杉醇的敏感性均不同程度的增加，并檢測到多藥耐藥蛋白P-gp、MRP和LRP的表達(dá)降低，提示NEDD4-1沉默能部分的提高肺腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，并可能通過調(diào)節(jié)PTEN增加凋亡

17、、抑制EMT表型或降低耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞的耐藥性，這一結(jié)論提示NEDD4-1可能成為逆轉(zhuǎn)肺腺癌化療耐藥的分子靶蛋白，其小分子抑制劑的研究為肺腺癌的治療提供了新的思路和方法。
　　總之，NEDD4-1在肺癌組織中高表達(dá)通過泛素化拮抗PTEN的活性，活化了PI3K/Akt細(xì)胞信號通路并作用于多種靶蛋白，從而促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞的生長，浸潤和遷移過程，同時還增加了肺腺癌細(xì)胞對于化療藥物的耐受性，并部分的促進(jìn)了肺多