1、目的:
　　1.比較分析胃癌細(xì)胞SGC-7901和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK等基因的表達(dá)差異，驗(yàn)證PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路在胃癌中的激活情況。
　　2.觀察mTOR抑制劑rapamycin對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的影響，探討PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路調(diào)控胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的可能分子機(jī)制，為該通路抑制劑應(yīng)用于臨床提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　3.觀察

2、并探討PD98059對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響及其作用機(jī)制，以期為胃癌的基礎(chǔ)研究和臨床治療提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　4.研究mTOR抑制劑rapamycin和MEK抑制劑PD98059聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞是否具有協(xié)同效應(yīng)，探討PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路的相互作用，揭示這兩條信號(hào)通路的相互調(diào)控機(jī)制，為制定胃癌基因水平的預(yù)防和治療以及為臨床研究新的靶向治療藥物及尋求新的聯(lián)合治療方案

3、提供學(xué)術(shù)依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)人低分化胃癌細(xì)胞株SGC-7901和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子PI3K、AKT、mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子MEK、ERK等相關(guān)基因的mRNA表達(dá);Western Blot法檢測(cè)總蛋白AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-E

4、RK1/2的定量表達(dá)。
　　2.應(yīng)用mTOR靶向抑制劑rapamycin干預(yù)胃癌細(xì)胞株MGC-803。MTT法檢測(cè)rapamycin對(duì)細(xì)胞增殖的影響;RT-qPCR測(cè)定PI3K、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K等基因的mRNA表達(dá);Western Blot檢測(cè)各總蛋白mTOR(Ser2448)、P70S6K和磷酸化蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-P70S6K(Thr389)的定量表達(dá);AnnexinⅤ-FITC/P

5、I染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率變化。
　　3.應(yīng)用MEK靶向抑制劑PD98059干預(yù)胃癌細(xì)胞株SGC-7901。CCK-8法檢測(cè)PD98059對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響;RT-qPCR檢測(cè)MEK、ERK等基因的mRNA表達(dá);Western Blot檢測(cè)各總蛋白MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白p-MEK1/2、p-ERK1/2的定量表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD98059對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響。

6、　　4.根據(jù)rapamycin和PD98059抑制胃癌細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果各選取一個(gè)藥物濃度點(diǎn)，設(shè)計(jì)單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥分組:對(duì)照組、rapamycin組、PD98059組、聯(lián)合組。RT-qPCR檢測(cè)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子PI3K、AKT、mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子MEK、ERK等相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。Western Blot檢測(cè)各組總蛋白AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2和磷酸化蛋白

7、p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2的定量表達(dá)。AnnexinⅤ-FITC/PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期分布和凋亡率的影響。
　　結(jié)果:
　　1.PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK通路關(guān)鍵信號(hào)分子在SGC-7901和GES-1細(xì)胞中的表達(dá)研究
　　RT-qPCR測(cè)定PI3K、AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表達(dá)，擴(kuò)增曲線良好，溶解

8、曲線表明特異性良好。SGC-7901細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平顯著高于GES-1細(xì)胞中的表達(dá)水平，具有顯著性差異(P＜0.05)。胃癌SGC-7901細(xì)胞和正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中總mTOR、AKT、MEK、ERK蛋白的表達(dá)水平組間無顯著性差異(P＞0.05)。但SGC-7901細(xì)胞中磷酸化蛋白p-mTOR、p-AKT、p-MEK、p-ERK蛋白的表達(dá)均顯著高于GES-1細(xì)胞，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.mTO

9、R抑制劑Rapamycin對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　與對(duì)照組相比，不同濃度rapamycin對(duì)MGC-803細(xì)胞均有抑制作用，且隨著rapamycin濃度的增加，MGC-803細(xì)胞增殖能力逐漸下降，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組的PI3K、AKT、mTOR、4EBP、P70S6K基因的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，隨著rapamycin濃度升高，其表達(dá)量均逐漸降低(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組總蛋白mTO

10、R(Ser2448)、P70S6K表達(dá)無明顯差異，磷酸化蛋白p-P70S6K(Thr389)、p-mTOR(Ser2448)隨著抑制劑濃度的增加蛋白表達(dá)量逐漸降低(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例逐漸上升，高于對(duì)照組(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例均低于對(duì)照組(P＜0.01)，G2/M期細(xì)胞比例逐漸下降，均低于對(duì)照組(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組凋亡率高于對(duì)照組(P＜0.01)，且隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　3.

11、PD98059靶向抑制MAPK/ERK信號(hào)通路對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響
　　實(shí)驗(yàn)組SGC-7901細(xì)胞增殖率均低于對(duì)照組(P＜0.01)。在一定范圍內(nèi)，隨著PD98059濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞增殖能力逐漸下降，抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當(dāng)抑制劑濃度達(dá)到200μmol/L時(shí)抑制作用趨緩，達(dá)到300μmol/L時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期，增值率無明顯變化，300μmol/L濃度組與400μmol/L濃度組間無差異(P＞0.05)。實(shí)

12、驗(yàn)組的MEK、ERK基因的mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組(P＜0.01)。隨著PD98059濃度的增加，ERK基因的mRNA表達(dá)量逐漸下降，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.01)。50μmol/L濃度組MEK基因的mRNA表達(dá)量高于25μmol/L、100μmol/L濃度組，低于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，25μmol/L濃度組MEK1/2蛋白表達(dá)無變化(P＞0.05)，而50μmol/L、100μmol/L濃度組表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.05);25μm

13、ol/L濃度組p-MEK1/2表達(dá)與對(duì)照組相比無明顯差異（P＞0.05），而50μmol/L、100μmol/L濃度組表達(dá)低于對(duì)照組(P＜0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性;各濃度組總ERK1/2表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，而各組磷酸化蛋白p-ERK1/2隨著抑制劑濃度的增加蛋白表達(dá)量逐漸降低(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組G0/G1期細(xì)胞比例逐漸上升，高于對(duì)照組(P＜0.01)，S期細(xì)胞比例逐漸升高，均低于對(duì)照組(P＜0.01)，

14、G2/M期細(xì)胞比例逐漸下降，均低于對(duì)照組(P＜0.01)。25μmol/L、50μmol/L濃度組凋亡率隨著濃度的增加而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性(P＜0.01)，而50μmol/L和100μmol/L濃度組間凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4.mTOR抑制劑Rapamycin聯(lián)合MEK抑制劑PD98059對(duì)胃癌細(xì)胞的協(xié)同作用及機(jī)制研究
　　rapamycin組和PD98059組的AKT、mTOR、MEK、ERK基因的m

15、RNA表達(dá)量均低于對(duì)照組（P＜0.05），聯(lián)合組的AKT、mTOR、MEK、ERK基因的mRNA表達(dá)量均低于各單獨(dú)用藥組(P＜0.05)。各組總AKT、mTOR、MEK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比無明顯差異(P＞0.05)。rapamycin組和PD98059組磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1/2、p-ERK1/2表達(dá)量均低于對(duì)照組(P＜0.05)。聯(lián)合用藥組磷酸化蛋白p-AKT、p-mTOR、p-MEK1

16、/2、p-ERK1/2表達(dá)量均低于rapamycin組和PD98059組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK信號(hào)通路在胃癌SGC-7901細(xì)胞中處于激活狀態(tài)，這兩條信號(hào)通路的異常改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　2.mTOR靶向抑制劑rapamycin對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有抑制作用，并抑制了胃癌細(xì)胞的增殖活性，將細(xì)胞周期阻滯于G

17、0/G1期，引起細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，揭示了PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與胃癌化療效果的相關(guān)性。
　　3.MEK靶向抑制劑PD98059可以通過抑制MAPK/ERK信號(hào)通路影響細(xì)胞的生物學(xué)活性，抑制胃癌細(xì)胞增殖，使細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終使胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。說明MAPK/ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059可以作為有效的抗癌藥物應(yīng)用于臨床。深入研究MAPK/ERK信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中