1、表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不變的前提下基因表達(dá)或細(xì)胞表型的可遺傳變化，主要包括DNA甲基化，組蛋白共價(jià)修飾，染色質(zhì)重塑，基因沉默和RNA編輯。其中，組蛋白修飾涉及許多生理生物化學(xué)過程，可通過調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而激活或抑制基因表達(dá)。LSD1（HistoneLysineSpecificDemethylase1，組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1）是2004年確認(rèn)的第一個(gè)組蛋白去甲基化酶，可去除組蛋白H3K4、H3K9和非組蛋白底物賴氨酸的甲基而調(diào)控

2、其生物學(xué)功能。LSD1在多種腫瘤中高表達(dá)，用LSD1抑制劑或RNAi降低LSD1活性或表達(dá)量可抑制腫瘤生長(zhǎng)。因此，獲得高效、低毒、高選擇性LSD1抑制劑是目前抗腫瘤藥物研究熱點(diǎn)。
　　LSD1作為MAO-A/B(MonoamineOxidaseA/B，單胺氧化酶A/B)同源蛋白，以FAD（FlavinAdenineDinucletide，黃素腺嘌呤二核苷酸）作為輔酶發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，許多通過與FAD相互作用而抑制MAO活性的

3、化合物亦可抑制LSD1活性，如2-PCPA（Tranylcypromine，苯環(huán)丙胺）。2010年有報(bào)道利用Click反應(yīng)合成含三氮唑的MAO-A抑制劑，因此我們推測(cè)含1，2，3-三氮唑小分子MAO-A抑制劑對(duì)LSD1亦具有一定抑制活性。與此同時(shí)，二硫代甲酸酯類化合物由于其廣泛的抗菌和抗腫瘤活性亦吸引我們的注意力。因此，本課題利用Click反應(yīng)和藥物設(shè)計(jì)中拼合原理，將1，2，3-三氮唑和氨基二硫代甲酸酯兩個(gè)活性片段拼合在一個(gè)分子之中，設(shè)

4、計(jì)并合成了一類含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯類化合物，檢測(cè)其對(duì)LSD1抑制活性，對(duì)其進(jìn)行衍生化，獲得高效、高選擇性LSD1抑制劑，并深入研究其體外、體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，抗腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲作用及作用機(jī)制。我們的研究結(jié)果和主要發(fā)現(xiàn)包括:
　　1)LSD1抑制劑篩選平臺(tái)的建立及LSD1抑制劑的設(shè)計(jì)與合成;
　　我們首先利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建了LSD1原核表達(dá)載體，并利用基因工程原核表達(dá)、分離純化出LSD1重組蛋白;同時(shí)為進(jìn)行選

5、擇性篩選，我們亦分離純化了LSD1的另一同源蛋白LSD2。由于LSD1、LSD2去甲基化過程中可生成一分子過氧化氫，本研究使用熒光探針AmplexRed定量檢測(cè)LSD1、LSD2作用于組蛋白底物過程中生成過氧化氫，定量判斷LSD1、LSD2活性及我們?cè)O(shè)計(jì)合成的小分子化合物對(duì)其活性抑制作用，建立篩選平臺(tái)。同時(shí)開展了1，2，3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯類LSD1抑制劑研究。通過對(duì)設(shè)計(jì)、合成69個(gè)化合物活性篩選和生物活性評(píng)價(jià)以及構(gòu)效關(guān)系分析，

6、發(fā)現(xiàn)一類具有全新結(jié)構(gòu)的LSD1抑制劑，其中活性最好的是化合物30，其對(duì)LSD1抑制活性IC50為2.11μM。因此，以下研究以化合物30為主要研究對(duì)象開展。
　　2)LSD1抑制劑在重組蛋白水平對(duì)LSD1活性的調(diào)控作用及其選擇性研究;
　　我們通過體外酶活性篩選實(shí)驗(yàn)證實(shí):LSD1抑制劑化合物30可特異性作用于LSD1，而對(duì)LSD2抑制活性較弱，對(duì)MAO-A/B無抑制活性。通過稀釋法和透析法研究發(fā)現(xiàn)，化合物30可通過非共價(jià)鍵與

7、LSD1呈可逆性結(jié)合并抑制LSD1活性。酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)揭示化合物30可能競(jìng)爭(zhēng)性作用于LSD1輔酶FAD所在活性口袋，可能是通過將FAD擠出LSD1活性中心調(diào)節(jié)LSD1活性;另一方面，化合物30亦有可能作用于LSD1別構(gòu)區(qū)，通過改變酶構(gòu)象將輔酶FAD“擠出”LSD1從而調(diào)節(jié)酶活性。分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步預(yù)測(cè)化合物30是LSD1輔酶FAD競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，化合物30可通過與LSD1形成分子間氫鍵占據(jù)FAD所在空穴位置，進(jìn)而抑制FAD與

8、LSD1的結(jié)合和活性。
　　3)LSD1抑制劑在細(xì)胞水平對(duì)LSD1抑制活性、抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用及其整體動(dòng)物水平生物活性評(píng)價(jià);
　　胃癌細(xì)胞MGC-803中，我們發(fā)現(xiàn)LSD1選擇性抑制劑化合物30可上調(diào)底物H3K4me1、H3K4me2和H3K9me2表達(dá)量，并特異性抑制LSD1高表達(dá)胃癌細(xì)胞系MGC-803、HGC-27細(xì)胞增殖，而對(duì)LSD1低表達(dá)胃黏膜正常細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系SGC-7901增殖無明顯抑制作用。同

9、時(shí)，化合物30可誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。整體動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)顯示，化合物30可抑制人胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)，并顯示出較低毒副作用。
　　4)LSD1抑制劑抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲作用及其作用機(jī)制研究;
　　劃痕實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在低于最低誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡濃度下，化合物30可抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示，化合物30可通過抑制LSD1與snai1相互作用，激活E-Ca

10、dherin啟動(dòng)子，上調(diào)EMT標(biāo)志蛋白E-Cadherin表達(dá)?；衔?0同時(shí)可抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-Cadherin表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。進(jìn)一步Elisa實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LSD1抑制劑化合物30可抑制MGC-803中TGFβ1（TransformingGrowthFactorbeta1，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1）表達(dá)，因此，我們推測(cè)化合物30通過調(diào)節(jié)LSD1活性及抑制TGFβ1表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞EMT(epithelial-mesen

11、chymaltransition，上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變)過程，最終抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。
　　5)胃癌細(xì)胞MGC-803及胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1中TGFβ1對(duì)LSD1調(diào)控及作用機(jī)制;
　　TGFβ超家族是一類結(jié)構(gòu)相似但功能不同的肽類物質(zhì)，其中TGFβ1含量最高并在癌癥發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在正常組織中TGFβ1扮演著抑癌基因作用，抑制腫瘤生長(zhǎng);而在腫瘤組織中，隨著腫瘤的惡化，TGFβ1可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。本課題研究發(fā)現(xiàn)胃

12、癌細(xì)胞MGC-803中，不同濃度TGFβ1可時(shí)間依賴性上調(diào)LSD1表達(dá)。分別應(yīng)用ERK抑制劑tangeretin，NF-κB抑制劑bay11-7085，p300抑制劑C646與TGFβ1聯(lián)用均可抑制TGFβ1誘導(dǎo)的LSD1過表達(dá)，提示TGF-β1對(duì)LSD1的表達(dá)調(diào)控依賴上述ERK，NF-κB及p300調(diào)控通路。由于p300能夠作用于LSD1啟動(dòng)子，我們應(yīng)用螢光雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)ERK、NF-κB、p300在TGFβ1誘導(dǎo)LSD1表

13、達(dá)上調(diào)過程中對(duì)LSD1啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)作用，因此推測(cè)TGFβ1可能通過激活ERK使其磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB使其亞基p65入核并被磷酸化，從而招募轉(zhuǎn)錄因子p300作用于LSD1啟動(dòng)子區(qū)，激活LSD1啟動(dòng)子并時(shí)間依賴性上調(diào)LSD1表達(dá)。而對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1，TGFβ1可失活ERK，從而阻斷NF-κB激活，抑制p65的磷酸化，對(duì)LSD1表達(dá)無影響。
　　通過上述研究工作，本課題共合成69個(gè)含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯類化合

14、物。并對(duì)其開展了LSD1活性篩選和評(píng)價(jià)，對(duì)化合物30開展了重點(diǎn)研究?；衔?0可逆性抑制LSD1活性，選擇性抑制LSD1高表達(dá)胃細(xì)胞系MGC-803和HGC-27增殖，并可通過抑制細(xì)胞EMT過程抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞MGC-803中TGFβ1激活ERK，NF-κB信號(hào)通路，招募p300激活LSD1啟動(dòng)子，上調(diào)LSD1表達(dá)。而胃黏膜上皮細(xì)胞中，TGFβ1對(duì)LSD1表達(dá)無調(diào)節(jié)作用。
　　本研究首次報(bào)道可同時(shí)抑