1、海洋是地球上最重要的生態(tài)系統(tǒng)之一,其中蘊(yùn)藏著種類(lèi)繁多的微生物類(lèi)群,是獲取新藥和新酶的寶貴資源,具有很好的開(kāi)發(fā)前景。地球表面的60％被深度超過(guò)1000米的海水所覆蓋,并且深海區(qū)地球表面覆蓋著生物和非生物來(lái)源的深海沉積物。由于巨大的廣度和深度,海底沉積物和上部洋殼是地球上最大的生態(tài)系統(tǒng)之一,蘊(yùn)藏著巨大的生物特別是微生物資源。海洋底部是一個(gè)極端環(huán)境,是嗜冷、嗜熱、嗜壓、嗜鹽和嗜低營(yíng)養(yǎng)等嗜極端環(huán)境微生物的理想來(lái)源。對(duì)這些極端微生物的研究開(kāi)發(fā)將會(huì)

2、在工業(yè)應(yīng)用、醫(yī)藥應(yīng)用、環(huán)境保護(hù)等方面具有潛在的、巨大的應(yīng)用價(jià)值。但是由于采樣和培養(yǎng)困難,對(duì)深海沉積物微生物資源的開(kāi)發(fā)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。因此,對(duì)深海沉積物中微生物資源的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)就具有重要的意義。
　　 本論文研究?jī)?nèi)容首先是對(duì)一株分離自南沖繩海槽深海沉積物的細(xì)菌SM.A87進(jìn)行了菌種鑒定。然后對(duì)菌株SM-A87進(jìn)行了全基因組測(cè)序,以期通過(guò)基因組信息揭示其在深海沉積物PON降解中的作用。Pseudoalteromonas sp.SM991

3、3是從沖繩槽附近海域1855米深的海底沉積物中分離的深海適冷菌。能分泌大量的胞外多糖和適冷蛋白酶。本論文對(duì)其全基因組序列進(jìn)行了測(cè)序和分析,并與南極淺海適冷菌Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125進(jìn)行了比較基因組學(xué)的研究。以期發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬內(nèi)深海細(xì)菌對(duì)深海環(huán)境適應(yīng)的獨(dú)特機(jī)制。Trichodermapseudokoningii SMF2是分離自海灘土壤的一株絲狀真菌。其對(duì)線蟲(chóng)有殺傷作用,并且其分泌的次

4、級(jí)代謝物哌珀霉素有抗菌和抗腫瘤活性。本論文對(duì)其基因組進(jìn)行了測(cè)序和分析。希望能夠發(fā)現(xiàn)哌珀霉素的產(chǎn)生途徑并為以后的研究做好基礎(chǔ)。
　　 菌株SM-A87的菌種鑒定:SM-A87分離自南沖繩海槽深海沉積物海底表層下2米,海水深度為1245米。SM-A87革蘭氏染色為陰性,無(wú)游動(dòng)和滑動(dòng)能力。在海水LB平板上28℃培養(yǎng)48h后,菌落呈黃色到橘紅色,菌落圓形且緊貼平板,不透明,直徑2-3mm,高1.2mm。菌體細(xì)胞呈短桿狀,長(zhǎng)約1.5-3.

5、3μm,寬約0.3-0.6μm。長(zhǎng)期培養(yǎng)可形成球狀菌體。
　　 SM-A87是嚴(yán)格好氧菌,氧化酶和接觸酶陽(yáng)性。產(chǎn)黃色色素,不形成芽孢。能在4-38℃范圍內(nèi)生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)溫度范圍為25-30℃。生長(zhǎng)的pH范圍是pH5.0-8.5,能在0-12％的NaCl濃度下生長(zhǎng),最適生長(zhǎng)NaCl濃度為3％。SM-A87含有黃桿菌科主要的呼吸醌MK-6。含有Flexirubin色素,主要合成末端分支的脂肪酸。
　　 SM-A87的DNA

6、G+C含量為35.8mol％。通過(guò)16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),與SM-A87最相近的菌株為黃桿菌科的Salegentibacter holothuriorum,兩者的16S rRNA基因序列相似性為92.9％。另外,SM-A8716S rRNA基因序列與同屬于黃桿菌科的Mesonia algae和Gramella portivictoriae相似性分別為91.8％和91.5％。
　　 綜合傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)、化學(xué)分類(lèi)學(xué)和分子

7、系統(tǒng)學(xué)分類(lèi)的結(jié)果,將SM-A87歸類(lèi)為黃桿菌科的一個(gè)新屬新種,定名為Wangia profunda。最后屬名在InternationalJournal of Systematic and Evolutionary.Microbiology(IJSEM)Validation List no.116上更改為Zunongwangia。
　　 Zunongwangia profunda SM-A87基因組學(xué)研究:SM-A87的全基因組只

8、有一條染色體,長(zhǎng)度為5128187bp,含有4653個(gè)預(yù)測(cè)的ORF,ORF平均長(zhǎng)度為960bp。有47個(gè)tRNA基因和3個(gè)rRNA操縱子。是目前為止Bacteroidetes第一個(gè)被測(cè)序的深海沉積物細(xì)菌?；蚪M中含有糖酵解,戊糖磷酸途徑和三羧酸循環(huán)的全部基因以及ED代謝途徑的關(guān)鍵酶。這反應(yīng)了SM-A87代謝途徑的多能性。
　　 SM-A87可以產(chǎn)生大量的莢膜多糖,基因組分析發(fā)現(xiàn)其基因組有兩個(gè)多糖合成和輸出的基因簇。SM-A87可

9、以編碼大量分泌型的水解酶。其中在130個(gè)肽酶中,61個(gè)帶有信號(hào)肽。并且?guī)盘?hào)肽的肽酶比不帶信號(hào)肽的肽酶更有嗜鹽特性,這有利于SM-A87在海水環(huán)境中對(duì)胞外蛋白質(zhì)進(jìn)行更好的水解。其胞外肽酶主要以金屬肽酶和絲氨酸肽酶為主。SM-A87中與糖類(lèi)分解和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酶也比較多。因此,深海來(lái)源的Bacteroidetes的菌株具有很強(qiáng)的對(duì)胞外有機(jī)碳和有機(jī)氮降解的能力。
　　 SM-A87中有兩個(gè)CRISPR位點(diǎn)。第一個(gè)位點(diǎn)為5595bp,第二

10、個(gè)位點(diǎn)為2115bp。CRISPR被認(rèn)為與抗病毒有關(guān),但是SM-A87的兩個(gè)CRISPR位點(diǎn)的間隔區(qū)序列在現(xiàn)有病毒庫(kù)中搜不到同源序列。這可能是由于現(xiàn)有病毒數(shù)據(jù)庫(kù)中僅包含了海洋病毒的很少一部分序列的因?yàn)椤?br>　　 SM-A87能耐受0-12％的NaCl,是中度嗜鹽菌。嗜鹽蛋白具有比較多酸性氨基酸殘基從而使自身等電點(diǎn)比較低。通過(guò)預(yù)測(cè)SM-A87基因組全蛋白的等電點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)其耐鹽特性。SM-A87胞外蛋白的等電點(diǎn)明顯低于胞內(nèi)蛋白的等電點(diǎn),

11、說(shuō)明其胞外蛋白比胞內(nèi)蛋白更具有嗜鹽性。同時(shí)也說(shuō)明SM-A87胞內(nèi)的鹽離子濃度不是很高,很可能是通過(guò)富集有機(jī)物來(lái)維持其細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡。其基因組能編碼甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)子也驗(yàn)證了這個(gè)推論。
　　 Pseudoalteromonas sp.SM9913基因組及比較基因組學(xué)研究:P.sp.SM9913(簡(jiǎn)稱(chēng) SM9913)是一株深海適冷菌,最適生長(zhǎng)溫度為15℃。P.haloplanktisTAC125是分離自南極表層海水的適冷菌,并且基因組

12、已經(jīng)測(cè)序完成。SM9913基因組由兩條染色體組成,大小分別為3.3Mb(染色體Ⅰ)和700kb(染色體Ⅱ),與P.haloplanktis TAC125(簡(jiǎn)稱(chēng)TAC125)兩條染色體的大小和結(jié)構(gòu)都很相似。SM9913的兩個(gè)染色體共含有3711個(gè)ORF,其中66.9％可以注釋上已有的或預(yù)測(cè)的功能。62個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA操縱子以及一個(gè)額外的5S rRNA基因都位于染色體I上。
　　 根據(jù)16S rRNA基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)表明

13、SM9913和TAC125在進(jìn)化關(guān)系上是非常接近的。SM9913和TAC125的平均核苷酸相似度為85％,說(shuō)明SM9913和TAC125是假交替單胞菌屬不同的種但是具有很高的相似性。兩者共有2698個(gè)直系同源基因,分別占SM9913和TAC125全部基因的72.7％和77.4％。SM9913中共鑒定出了12個(gè)長(zhǎng)度大于15kb的基因島(gene island,GI)。其中11個(gè)位于染色體Ⅰ,一個(gè)位于染色體Ⅱ。基因島中的基因大部分是在TAC

14、125中沒(méi)有直系同源基因的SM9913特有基因,所以這些基因島的特有基因會(huì)賦予SM9913一些區(qū)別于TAC125的特性。
　　 與TAC125相比,SM9913中雙加氧酶?jìng)€(gè)數(shù)比較少并且缺少TAC125中與H2O2抗性相關(guān)的脂肪酸代謝基因簇。因此推測(cè)SM9913對(duì)H2O2比較敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),SM9913只能在5mM H2O2濃度下生長(zhǎng),而TAC125可以在10-15mM H2O2濃度下生長(zhǎng)。這可能是因?yàn)樯詈３练e物中氧