1、納豆激酶(Nattkoinase，NK)是納豆發(fā)酵過程中由納豆芽胞桿菌(Bacillus subtilis natto)產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶。納豆激酶具有纖溶活性，可預(yù)防和治療血栓疾病，它還可激活體內(nèi)的纖溶酶原，從而增加內(nèi)源性纖溶酶的量。通過枯草芽胞桿菌來表達納豆激酶基因是獲得納豆激酶的重要途徑之一。
　　枯草芽胞桿菌自身能分泌大量的胞內(nèi)蛋白酶和胞外蛋白酶，這使得純化枯草芽胞桿菌宿主所表達的異源蛋白酶變得困難，而且也使枯草芽胞桿

2、菌表達的異源蛋白容易被宿主所分泌的蛋白酶降解?？莶菅堪麠U菌自身所分泌的蛋白酶為將枯草芽胞桿菌開發(fā)為優(yōu)良異源蛋白的表達系統(tǒng)宿主帶來許多障礙。因此，研究枯草芽胞桿菌所分泌的蛋白酶對其表達異源蛋白體系的影響有重要意義。
　　目前已知枯草芽胞桿菌168（Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168）能分泌8種蛋白酶，它們的基因分別為：nprE、aprE、epr、bpr、mpr、nprB、vpr和wpr

3、A。本研究選擇了aprE、vpr、wprA這3種蛋白酶基因為靶標(biāo)，重點研究了它們對枯草芽胞桿菌納豆激酶表達體系的影響。
　　采用超表達的方法來研究枯草芽胞桿菌168中aprE、vpr和wprA這3種蛋白酶基因的超表達對該菌株表達重組納豆激酶基因的影響。將這3個蛋白酶基因分別克隆到表達載體pBE43上，然后重組表達載體（pBE43-aprE、pBE43-vpr、pBE43-wprA）分別在枯草芽胞桿菌168中表達。提取含有這3種超表

4、達蛋白的培養(yǎng)上清液，補加到枯草芽胞桿菌168表達重組納豆激酶的發(fā)酵對數(shù)期細(xì)胞中。通過纖維蛋白平板檢測納豆激酶酶活方法來觀察不同蛋白培養(yǎng)上清對納豆激酶表達活性的影響。初步結(jié)果表明：aprE的超表達上清液對納豆激酶表達有促進作用，vpr的超表達上清液抑制納豆激酶的表達活性，wprA的超表達上清液對納豆激酶表達有輕微抑制作用。
　　采用基因敲除的方法進一步驗證了宿主枯草芽胞桿菌168中aprE、vpr和wprA這3種基因的單個缺失對枯草

5、芽胞桿菌168表達重組納豆激酶基因的影響。獲得3種蛋白酶基因的單缺失宿主菌株△aprE、△vpr和△wprA，并將重組納豆激酶表達載體pBE43-NA轉(zhuǎn)入這3種單缺失菌株進行表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失單個蛋白酶宿主菌所表達納豆激酶活性比原始菌株所表達的納豆激酶活性都要低，這說明宿主枯草芽胞桿菌168中aprE、vpr或wprA基因的缺失不利于納豆激酶的表達活性提高。
　　綜合以上兩種方法的實驗結(jié)果可知：在以枯草芽胞桿菌168作為宿主菌表達