1、結腸癌(colorectal cancer，CRC)是人類疾病中常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率位居人類惡性腫瘤第三位。臨床上多表現為消瘦、貧血、便血、腹痛等，其易發(fā)生遠處轉移，約50％患者發(fā)現時已發(fā)生肝轉移，因此患者在病程后期常因梗阻性黃疸、肝衰竭等原因死亡。目前結腸癌治療上雖然以外科手術為主，但是藥物抗腫瘤治療亦是重要治療手段，有助于患者病情的控制，提高患者生命質量。
　　人類惡性腫瘤的發(fā)生不僅與細胞的異常增生有關，還與細胞的凋

2、亡受阻，致使腫瘤細胞無限制惡性增生有密切關系。惡性腫瘤的轉移過程中包括血管生成、細胞粘附、侵襲、轉移及增殖等等。因此，細胞凋亡在控制腫瘤細胞增殖、腫瘤發(fā)生及腫瘤生長過程中起到至關重要的作用。現代藥理學研究發(fā)現，一些中國傳統(tǒng)中藥具有很好的抑制腫瘤生長作用。
　　天花粉為葫蘆科植物瓜蔞或雙邊瓜蔞的干燥根，現代藥理學研究發(fā)現其具有終止妊娠、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗病毒等多種藥理活性。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是一種從中

3、藥瓜蔞塊根中分離提純的有效成分，屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白，具有RNAN-糖苷酶活性，能夠水解真核細胞核糖體28S rRNA特定位點的腺苷酸，從而抑制細胞蛋白質的合成。既往實驗發(fā)現，TCS具有潛在的抗腫瘤作用。
　　本文研究天花粉蛋白抑制結腸癌細胞生長作用，并在細胞內進行天花粉蛋白及其突變體Y(酪氨酸)70A(丙氨酸)、R（精氨酸）163Q（谷氨酰胺）TCS生物活性功能研究。結果顯示:(1) TCS對結腸癌HCT116細胞的生長有明顯

4、的抑制作用，HCT116細胞出現細胞皺縮、變形，并且細胞凋亡呈現明顯的濃度和時間依賴性;(2) TCS可將結腸癌HCT116細胞阻滯于S期;(3) TCS可誘導HCT116細胞發(fā)生凋亡;(4) Western blotting檢測結果顯示caspase-3酶原，caspase-9酶原，PARP表達降低，呈現濃度依賴性。TCS處理可活化Akt、pAkt上升;(5)在細胞內，野生種TCS能抑制熒光素酶活性，突變體Y70A則不能抑制熒光素酶活

5、性，而突變種R163Q對熒光素酶活性抑制作用強于野生種TCS。
　　本研究共分為兩部分內容。
　　第一部分TCS抑制結腸癌HCT116細胞生長作用的研究
　　研究目的:研究天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)對人結腸癌細胞生長抑制的影響。
　　研究方法:人結腸癌HCT116細胞，分設TCS實驗組（濃度分別為7.0μM、14μM、28μM）和陰性對照組。實驗中(1)采用倒置顯微鏡觀察TCS對HCT116

6、細胞形態(tài)及增殖的影響;(2)采用流式細胞儀檢測TCS對HCT116細胞周期以及TCS對HCT116細胞凋亡影響;(3)應用Western blotting檢測結腸癌HCT116細胞caspase-3酶原，caspase-9酶原;PARP; pAkt;Akt變化。
　　研究結果:(1) TCS處理明顯抑制結腸癌HCT116細胞的生長，HCT116細胞出現細胞皺縮、變形，體積變小，并且細胞凋亡呈現明顯的濃度和時間依賴性;(2) TCS

7、可將結腸癌HCT116細胞阻滯于S期;(3) TCS可誘導HCT116細胞發(fā)生凋亡;(4) Western blotting法檢測結果顯示caspase-3酶原，caspase-9酶原，PARP表達降低，呈濃度依賴性。TCS處理激活Akt，磷酸化Akt升高。
　　研究結論:TCS可抑制結腸癌HCT116細胞生長，呈藥物濃度和作用時間依賴性。TCS可將HCT116細胞阻滯于S期，并誘導HCT116細胞凋亡。caspase-9、cas

8、pase-3的激活為介導TCS誘導HCT116細胞發(fā)生凋亡的通路，結果提示與PI3K/Akt通路調節(jié)有關系。
　　第二部分天花粉蛋白及其突變體Y70A、R163Q TCS生物活性研究
　　研究目的:在細胞內進行天花粉蛋白野生種(TCS)及天花粉蛋白突變體Y70A、R163Q TCS生物活性比較;
　　研究方法:以pAAV-CMV-TCS為載體，通過定點突變、質粒轉化、擴增、提取、測序、轉染等方法構建突變種Y70A、R1

9、63Q TCS。在細胞內通過熒光素酶活性測定，進行野生種TCS與突變種TCS活性比較。
　　研究結果:熒光素酶報告基因檢測，單獨或與野生種TCS、突變種Y70A、R163Q共轉染293T細胞。在細胞內，野生種TCS能抑制熒光素酶活性，突變種Y70A則不能抑制熒光素酶活性，而突變種R163Q對熒光素酶活性抑制作用強于野生種TCS。
　　研究結論:通過野生種TCS，突變種Y70A和R163Q在細胞內對熒光素酶活性影響的比較，結果