1、研究背景:
　　骨質(zhì)疏松癥是當下社會最常見的骨骼系統(tǒng)疾病，是一個嚴重的公共健康問題。骨質(zhì)疏松的特點就是全身性的骨量流失、骨微結(jié)構(gòu)損傷、骨質(zhì)量降低最終導致脆性骨折。年齡超過50歲的約20％的女性和7％左右的男性均患有骨質(zhì)疏松癥，而其中一半的人經(jīng)歷過骨質(zhì)疏松性骨折，尤其是髖部、腕部和椎體部位的骨折。從細胞病理生理學的角度來講，導致骨質(zhì)疏松癥的原因是破骨細胞的功能活性超過了成骨細胞的活性。傳統(tǒng)意義上講，骨質(zhì)疏松癥被認為是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)疾

2、?。ㄓ绕涫谴萍に夭蛔銓е碌睦^發(fā)性骨質(zhì)疏松癥）;但是越來越多的研究證實慢性炎癥性疾?。愶L濕性關(guān)節(jié)炎、強制性脊柱炎、克隆恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性阻塞性肺病、特定病毒感染）與骨質(zhì)疏松性骨折關(guān)系密切。臨床實踐和基礎(chǔ)實驗研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥和免疫系統(tǒng)介導的炎癥狀態(tài)之間有著緊密的聯(lián)系，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎，獲得性免疫缺陷綜合征，并且進一步發(fā)現(xiàn)一種更普通的炎癥狀態(tài)同樣被確認為骨質(zhì)疏松性骨折的病理性因素，像老齡化。在所有的情況下，導致骨組織病變的最主要的

3、病理機制似乎就是炎癥反應(yīng)。從這個觀點出發(fā)，可以認為骨質(zhì)疏松癥是一種免疫系統(tǒng)介導的疾病，發(fā)病過程是免疫激活，通過誘導產(chǎn)生細胞因子和炎癥反應(yīng)，導致破骨細胞和成骨細胞活性重構(gòu)和骨轉(zhuǎn)換的失調(diào)節(jié)，結(jié)果就是骨吸收活動增強從而產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥。
　　骨組織和免疫系統(tǒng)通過復雜的自平衡網(wǎng)絡(luò)達到功能上的整體性，并且從各個方面來講，骨質(zhì)疏松癥可以被認定為一種慢性免疫系統(tǒng)介導的炎性疾病，因為骨質(zhì)疏松癥與臨床上其它多種炎性疾病有相同的臨床和生物學特征。經(jīng)過近

4、幾年的努力，關(guān)于免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)之間相互作用的認識得到明顯提升;早在2000年，“骨骼免疫學”就已經(jīng)被提出來了。自那時開始，骨骼免疫學越來越得到大家的重視，此領(lǐng)域的研究也變得越來越深入。因此骨免疫學已經(jīng)明確了作為一個跨學科研究和臨床領(lǐng)域，它可以對一些臨床上常見病、多發(fā)病，例如骨質(zhì)疏松癥，對發(fā)病機理和臨床癥狀進行全新的解釋。與其相關(guān)的領(lǐng)域不斷擴大，大大豐富了其轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的數(shù)量，尤其在臨床實踐和醫(yī)學的不同分支。骨免疫學概念的重點放在橋接著兩

5、個器官系統(tǒng)的病理生理狀態(tài)的原因上，包括骨質(zhì)疏松癥、老齡化、圍絕經(jīng)期、炎性關(guān)節(jié)炎、癌癥、代謝障礙和神經(jīng)失調(diào)癥等。
　　許多分子影響破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成之間的平衡。成骨細胞可以分泌產(chǎn)生正性調(diào)節(jié)和負性調(diào)節(jié)破骨細胞生成的因子如RANKL和OPG。破骨細胞分化由RANKL與RANK結(jié)合啟動。成骨細胞是產(chǎn)生RANKL的主要來源，但是骨細胞、成纖維細胞或者免疫系統(tǒng)也產(chǎn)生RANKL。通過RANKL信號通路，免疫系統(tǒng)激活后可以直接誘導

6、破骨細胞生成和促進骨吸收活性。已經(jīng)有研究證實了免疫細胞，像活化的T淋巴細胞和B淋巴細胞，還有樹突狀細胞，都表達RANKL。甚之，RANKL刺激骨吸收活性的介質(zhì)是NFATc1，而它是免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的一個關(guān)鍵因子。
　　定植于骨髓中的T淋巴細胞是調(diào)節(jié)骨重建的關(guān)鍵性免疫細胞，也是生理和病理條件下，骨細胞對甲狀旁腺激素產(chǎn)生反應(yīng)性的關(guān)鍵細胞。在炎癥性疾病或者全身性的系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)為特征的狀態(tài)，像絕經(jīng)期和老齡化，破細胞骨吸收是由活化的T淋巴細胞

7、所驅(qū)動。然而，骨髓T細胞同樣參與骨代謝平衡過程，通過誘導骨形成或者與骨細胞的直接的相互作用。兩種機制牽涉其中，T細胞共刺激分子與它們骨細胞和前體細胞表面反受體的結(jié)合，成骨細胞系Wnt信號通路的活化釋放Wnt配體和細胞因子。T淋巴細胞對骨組織的作用效果最終決定于它們的活化狀態(tài)和它們特殊的基因型。不僅免疫系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)骨重建，骨組織同樣可以影響免疫系統(tǒng)，主動影響免疫細胞。相同的骨細胞可以影響甚至表現(xiàn)出許多免疫功能，就像細胞因子生產(chǎn)和抗原提呈作

8、用。從此種意義上講，骨組織可以被認為是一種廣義上的免疫系統(tǒng)。骨細胞分泌產(chǎn)生的細胞因子可以促使原始T細胞分化成不同的細胞系，導致成熟T細胞的擴增，從而進一步調(diào)節(jié)骨代謝平衡。破骨細胞選擇性募集和活化CD8+T細胞，表達CD25和FoxP3。反過來，這些CD8+T細胞抑制骨吸收，降低炎癥或者破骨細胞生成細胞因子的生成，刺激骨形成，產(chǎn)生了一個調(diào)節(jié)環(huán)路:破骨細胞和RANKL誘導調(diào)節(jié)T細胞，調(diào)節(jié)T細胞使破骨細胞生成的骨吸收活動鈍化。
　　含氮

9、雙磷酸鹽治療骨質(zhì)疏松癥和Paget病的藥物，還廣泛應(yīng)用于治療和預防腫瘤相關(guān)的骨骼病變。唑來膦酸是一種側(cè)鏈含有咪唑環(huán)的雙磷酸鹽，每年靜滴一次，通過抑制骨吸收來提高骨密度。唑來膦酸已經(jīng)在很多國家進入臨床應(yīng)用，用來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥和老年性骨質(zhì)疏松癥。靜脈應(yīng)用唑來膦酸后的24-36小時內(nèi)經(jīng)常出現(xiàn)發(fā)熱和全身肌肉骨骼酸痛，被稱為急性期反應(yīng)，原因可能與外周血中淋巴細胞暫時下降有關(guān)。目前已經(jīng)證實的是急性期反應(yīng)與γδT細胞

10、的活化和致熱細胞因子的釋放有關(guān)。研究證實含氮雙磷酸鹽抑制法尼基焦磷酸合酶導致相鄰的單核細胞內(nèi)上游代謝產(chǎn)物聚集，包括異戊烯基焦磷酸酯等。靜脈應(yīng)用或口服含氮雙磷酸鹽會導致至少持續(xù)1年的γδT細胞的下降。并且證實靜脈應(yīng)用含氮雙磷酸鹽比口服用藥γδT細胞的下降的程度更明顯。近來臨床研究發(fā)現(xiàn)唑來膦酸不僅僅影響γδT細胞，同樣影響總白細胞、淋巴細胞、CD+T細胞和嗜酸性細胞。外周血循環(huán)中γδT細胞的持續(xù)下降可能有重要的意義。γδT細胞只是外周血中1

11、-10％CD3+T細胞，它們在上皮組織中的表達更豐富些。外周血淋巴細胞下降也可能是唑來膦酸影響了破骨細胞的功能及影響造血干細胞的結(jié)果。Kalyan等人曾經(jīng)提出，雙磷酸鹽導致的下頜骨壞死是因為γδT細胞細胞明顯下降引起免疫長期效應(yīng)改變的結(jié)果。以上實驗結(jié)果都提示骨代謝與免疫系統(tǒng)之間緊密的聯(lián)系，唑來膦酸治療骨質(zhì)疏松癥可能是通過影響免疫系統(tǒng)來發(fā)揮抑制骨吸收的作用。
　　目的:
　　通過通過觀察原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者第1次、第2次靜脈滴

12、注唑來膦酸后短時間（1～3天），及唑來膦酸作用長時間后（1年）外周血細胞計數(shù)、淋巴細胞亞群及骨代謝標志物的變化，探討淋巴細胞免疫系統(tǒng)在唑來膦酸抗骨質(zhì)疏松過程中的變化及意義。
　　方法:
　　1.研究對象:選取自2015年1月起至2016年11月就診于濟南市中心醫(yī)院疼痛科的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥住院患者30例。患者納入標準為:確診為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者;此前未應(yīng)用雙磷酸鹽藥物治療;肝功能、血清鈣離子、磷離子水平在正常范圍;肌酐清除率

13、＞35ml/min。排除標準:患有血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤、嚴重感染、用藥前發(fā)熱的患者。唑來膦酸（密固達，5mg，諾華公司）給藥方法嚴格按照說明書進行，每年靜脈滴注給藥1次（至少30分鐘以上），共用2次，治療期間所有患者同時使用鈣劑（600mg/天）和骨化三醇（0.5μg/天）作為基礎(chǔ)補充。
　　2.觀察指標:
　　2.1.于首次應(yīng)用唑來膦酸前、用藥1年后，觀察下列指標:
　　應(yīng)用定量CT(QCT)檢測腰椎骨密

14、度;應(yīng)用電化學發(fā)光法檢測外周血骨代謝標志物:骨鈣素(N-MID)、甲狀旁腺激素(PTH)、25(OH)D、I型膠原羧基端β特殊序列(β-CTx)水平。應(yīng)用全自動五分類血液分析儀檢測血細胞分析，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血離子水平，應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測外周血淋巴細胞亞群(CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD8+細胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+細胞、CD19+細胞）。
　　2.2.于首次及第

15、2次應(yīng)用唑來膦酸前及用藥后第1天、2天、3天，觀察下列指標:
　　應(yīng)用全自動五分類血液分析儀檢測血細胞分析，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測血離子水平，應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測外周血淋巴細胞亞群（CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD8+細胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+細胞、CD19+細胞）。
　　結(jié)果:
　　首次應(yīng)用唑來膦酸治療，30例原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者入組，男性9例，女性21例，平

16、均年齡為（73.28±6.44）歲;第2次應(yīng)用唑來膦酸時，退出4例，剩余26例患者完成研究，男性7例，女性19例，平均年齡為（75.21±5.01）歲。
　　1.首次應(yīng)用唑來膦酸1年后與用藥前相比，患者腰椎骨密度T值由（-3.78±0.76）提高到（-2.83±0.65），差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);外周血骨代謝標志物N-MID、PTH、25(OH)D變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而β-CTx明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意

17、義(P＜0.01)。血細胞分析、血離子水平、淋巴細胞亞群差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.1.與用藥前相比，首次應(yīng)用唑來膦酸后第1天，外周血白細胞總數(shù)(WBC)、中性粒細胞計數(shù)(NEU)、中性粒細胞百分比(NEU％)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），淋巴細胞計數(shù)(LYM)、淋巴細胞百分比(LYM％)、嗜酸性細胞計數(shù)(EOS)、嗜酸性細胞百分比(EOS％)下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），嗜堿性細胞(B

18、AS)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)及血小板計數(shù)(PLT)改變均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　外周血離子鈉離子(Na)、鈣離子(Ca)、磷離子(P)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);鉀離子、氯離子水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。淋巴細胞亞群變化結(jié)果，CD3+細胞（T淋巴細胞）、CD3+CD4+細胞（輔助T細胞）、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+細胞（NK細胞），

19、明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); CD3+CD8+細胞（細胞毒性T細胞）、CD19+細胞（B淋巴細胞），細胞計數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.2.與用藥前相比，首次應(yīng)用唑來膦酸后第2天，外周血細胞NEU％明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），LYM、LYM％、EOS、EOS％仍明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01），其余細胞改變無統(tǒng)計學意義。
　　外周血離子Na、K、Ca、P

20、明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); Cl水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　淋巴細胞亞群變化結(jié)果，CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+細胞明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01); CD3+CD8+細胞、CD19+細胞，細胞計數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　2.3.與用藥前相比，首次應(yīng)用唑來膦酸后第3天，外周血WBC明

21、顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），LYM計數(shù)仍明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其余細胞改變無統(tǒng)計學意義。
　　外周血離子Ca、P水平仍明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);Na、K離子差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　淋巴細胞亞群變化結(jié)果，CD3+細胞、CD3+CD4+細胞、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值仍降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CD16+CD56+細胞，明顯下降

22、，差異仍具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）; CD3+CD8+細胞、CD19+細胞計數(shù)降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.1.第2次應(yīng)用唑來膦酸后第1天，與此次用藥前相比，外周血細胞NEU％明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其它細胞差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;血離子水平及淋巴細胞亞群變化均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　3.2.第2次應(yīng)用唑來膦酸后第2天，與此次用藥前相比，外周血細胞WBC、

23、NEU、NEU％上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，LYM％、EOS％下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。血離子Ca、P差異無統(tǒng)計學意義。淋巴細胞亞群中CD3+CD4+細胞計數(shù)明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其余分類差別無統(tǒng)計學意義。
　　3.3.第2次應(yīng)用唑來膦酸后第3天，與此次用藥前相比，血細胞分析、血離子水平、淋巴細胞亞群結(jié)果，變化均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.原

24、發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者首次應(yīng)用唑來膦酸后3d內(nèi)，外周血中性粒細胞計數(shù)及比例先上升后下降，淋巴細胞、嗜酸性細胞、嗜堿性細胞比例下降;血清鈣離子、磷離子水平下降; CD3+細胞計數(shù)、CD3+CD4+細胞計數(shù)、CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、CD16+CD56+細胞計數(shù)均明顯下降，證實唑來膦酸短時間內(nèi)下調(diào)原發(fā)性骨質(zhì)疏松患者外周血T細胞、CD4+T細胞及NK細胞計數(shù)，同時下調(diào)嗜酸性細胞，對淋巴免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。
　　2.原發(fā)性骨質(zhì)疏松

25、癥患者第2次應(yīng)用唑來膦酸后3d內(nèi)，外周中性粒細胞計數(shù)及百分比增高、淋巴細胞計數(shù)及百分比降低幅度明顯降低，淋巴細胞亞群中CD3+CD4+細胞在第2d時降低，降低幅度明顯低于首次用藥后變化。這與第二次用藥急性期反應(yīng)發(fā)生率、反應(yīng)程度明顯降低相符，不僅證實了急性期反應(yīng)與唑來膦酸影響外周血淋巴細胞有關(guān)，更證實了唑來膦酸對淋巴細胞免疫系統(tǒng)的直接影響作用。
　　3.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者應(yīng)用唑來膦酸1年后，骨吸收活性下降，骨密度增加，骨質(zhì)疏松癥患