1、目的：肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，PLC）的90％以上，是世界上腫瘤死亡的主要原因之一，我國(guó)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率、死亡率均占全世界的50%以上，提高肝癌的早期診斷率和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療肝癌的有效藥物，對(duì)于改善肝癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量是非常有必要；miRNA異常表達(dá)于各種惡性腫瘤中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；當(dāng)前研究顯示 miR-429在不同腫瘤中

2、的表達(dá)水平和作用有明顯差異，提示miR-429作為一個(gè)原癌或抑癌miR，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，對(duì)腫瘤的診斷、治療和預(yù)后有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值；本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肝癌中 miR-429的表達(dá)情況，研究了其對(duì)肝癌增殖、遷移的影響，分析其靶基因TRAF6的表達(dá)及對(duì)肝癌增殖、遷移的影響，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究其在調(diào)節(jié)肝癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系。
　　方法：
　　1、臨床標(biāo)本和肝癌細(xì)胞系中采用Real time PCR檢測(cè)miR-429的

3、表達(dá)情況；
　　2、在體外實(shí)驗(yàn)中，使用miR-429慢病毒和對(duì)照組空白慢病毒miR-CON分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系SK-HEP1，然后采用MTT檢測(cè)miR-429對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖能力的影響；利用wound healing和Transwell實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miR-429對(duì)肝癌細(xì)胞系遷移能力的影響；
　　3、運(yùn)用生物信息學(xué)、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-429的靶基因；
　　4、采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、回復(fù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-429與TRAF6的相互

4、調(diào)控關(guān)系，采用免疫熒光、Western blot檢測(cè)miR-429在調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖中的核心信號(hào)通路；
　　5、采用裸鼠荷瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-429對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)Real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-429在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯降低，在癌旁組織中miR-429的表達(dá)水平較肝癌組織增加1.47倍；通過(guò)Real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常肝細(xì)胞HL7702對(duì)比，肝癌細(xì)胞中

5、miR-429的表達(dá)明顯下調(diào)，其中SK-HEP1的表達(dá)下調(diào)最為明顯。
　　2、與轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組miR-CON相比，miR-429抑制肝細(xì)胞系増殖和生長(zhǎng)能力（MTT法），提示miR-429可以影響肝癌的增殖能力。為檢測(cè)miR-429是否會(huì)影響肝癌細(xì)胞遷移能力，我們進(jìn)行了wound healing和Transwell實(shí)驗(yàn)，與對(duì)照組相比，SK-HEP1轉(zhuǎn)染miR-429后愈合率下降到原來(lái)的65.52%；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，與

6、對(duì)照組相比，SK-HEP1轉(zhuǎn)染miR-429后遷移能力下降到原來(lái)的45.67%。以上的結(jié)果顯示，miR-429在肝癌細(xì)胞系中對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力具有明顯的抑制作用。
　　3、采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)肝癌中TRAF6是miR-429的靶基因。與突變型載體 TRAF6-3’UTR-MUT相比，TRAF6-3’UTR-WT轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光信號(hào)值僅為對(duì)照的0.52；與空白載體相比，轉(zhuǎn)染TRAF6-3’UTR-WT野生型的細(xì)胞中的熒光信

7、號(hào)值沒(méi)有發(fā)生變化。以上結(jié)果顯示，miR-429通過(guò)與野生型載體中的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，誘導(dǎo)了載體的降解并降低了熒光信號(hào)的釋放。我們進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)了miR-429對(duì)TRAF6蛋白表達(dá)的影響：與轉(zhuǎn)染空白載體的肝癌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-429的細(xì)胞TRAF6蛋白的表達(dá)明顯降低。因此，在肝癌細(xì)胞中表達(dá)増加的miR-429可以有效降低TRAF6蛋白質(zhì)表達(dá)水平。TRAF6在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織中的表達(dá)，miR-4

8、29在肝癌組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，提示 miR-429在肝癌中可能作為抑癌因子存在，miR-429對(duì)肝癌腫瘤細(xì)胞増殖和侵襲的抑制作用可被TRAF6的髙表達(dá)逆轉(zhuǎn)，TRAF6是miR-429的靶基因。
　　4、在經(jīng)過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，TRAF6蛋白質(zhì)在肝癌中呈明顯的過(guò)度表達(dá)（P＜0.01）。TRAF6主要是細(xì)胞質(zhì)著色為主，僅有散在的細(xì)胞核著色，其中強(qiáng)表達(dá)病例數(shù)高這80%（20/25）。為檢測(cè)TRAF6蛋白的表達(dá)増加是否可以逆轉(zhuǎn)mi

9、R-429的腫瘤抑制作用，我們首先使用 siTRAF6轉(zhuǎn)染了 HCCLM3細(xì)胞系，與對(duì)照組相比較，siTRAF6組的細(xì)胞增殖能力、遷移能力受到了明顯的抑制；但是當(dāng)該組細(xì)胞轉(zhuǎn)染了anti-miR-429后，其對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力得到了明顯的抑制，與對(duì)照組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在體外細(xì)胞系中，我們將 HCC細(xì)胞感染了 LV-miR-429，然后采用免疫熒光檢測(cè)P65的表達(dá)，結(jié)果顯示P65明顯的分布于細(xì)胞質(zhì)，而經(jīng)pcDNA-TRAF6轉(zhuǎn)染

10、后，P65再次聚集于細(xì)胞核內(nèi)。該結(jié)果表明miR-429在調(diào)控NF-kB信號(hào)通路中起著重要的作用。miR-429轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致pTAK1，cMyc和TRAF6表達(dá)的降低，而將該組重新轉(zhuǎn)染pcDNA-TRAF6后，發(fā)現(xiàn)pTAK1，cMyc和TRAF6表達(dá)恢復(fù)到與對(duì)照組一致，該結(jié)果說(shuō)明TRAF6表達(dá)的增加可抵消miR-429對(duì)HCC細(xì)胞系NF-kB信號(hào)通路分子的影響。綜合以上結(jié)果表明：miR-429通過(guò)調(diào)控TRAF6的表達(dá)經(jīng)由NF-k

11、B信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。
　　5、我們也在體內(nèi)環(huán)境下利用裸鼠模型檢測(cè)了miR-429對(duì)肝癌腫瘤生長(zhǎng)的作用。結(jié)果顯示與對(duì)照miR-CON轉(zhuǎn)染細(xì)胞的皮下種植瘤模型相比，miR-429轉(zhuǎn)染的皮下種植瘤的生長(zhǎng)明顯受到了抑制。在注射腫瘤細(xì)胞24天后，轉(zhuǎn)染miR-429的腫瘤平均體積為對(duì)照組腫瘤體積的53.39%。通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRAF6和P65的表達(dá)明顯降低。因此，miR-429轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后可在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中顯著降低腫瘤細(xì)胞的