1、煙草是管狀花目茄科的一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。與其他植物相比，煙草具有較高的生物堿含量。通常情況下，煙草中含量最高的生物堿是煙堿（Nicotine）。煙堿可以使人的神經(jīng)系統(tǒng)興奮，具有提神醒腦鎮(zhèn)靜的作用，同時(shí)它也是栽培煙草的重要品質(zhì)要素。煙堿在煙堿去甲基化酶（Nicotine demethylase, NND）的催化下可以生成降煙堿（Nornicotine），降煙堿是煙草中的毒性成分，能夠使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌，同時(shí)也可對人體健康產(chǎn)生直接的負(fù)面影響。煙

2、草的生物堿組成中，降煙堿含量占煙堿與降煙堿總和的百分比稱為煙堿轉(zhuǎn)化率。栽培煙草的煙堿轉(zhuǎn)化率種內(nèi)差異相對比較穩(wěn)定，而種間差異很大，這種差異主要是由遺傳基因不同而引起的。栽培煙草中編碼煙堿去甲基化酶的基因主要有 CYP82E4、CYP82E5v2和 CYP82E10。本文以栽培煙草白肋煙TN90、紅花大金元及K326為實(shí)驗(yàn)材料，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除煙堿去甲基化酶基因，以期獲得低煙堿轉(zhuǎn)化率的煙草低害素材。
　　本研究主要內(nèi)

3、容包括：①在栽培煙草白肋煙TN90、紅花大金元及K326基因組中分別克隆了煙堿去甲基化酶基因CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10的外顯子1，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。測序及分析結(jié)果顯示三種栽培煙草的煙堿去甲基化酶基因外顯子1序列均為939bp，且不同煙草栽培品種的同一煙堿去甲基化酶基因序列完全一致。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明三個(gè)基因的外顯子1均含有細(xì)胞色素P450酶高度保守區(qū)域以及底物識別結(jié)合相關(guān)區(qū)域。②在煙堿去甲基化酶基因

4、外顯子1上設(shè)計(jì)敲除靶位點(diǎn)。每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)4個(gè)靶位點(diǎn)，三個(gè)基因共同的靶位點(diǎn)2個(gè)，共計(jì)14個(gè)敲除靶位點(diǎn)。根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，分別構(gòu)建了煙堿去甲基化酶基因CYP82E4、CYP82E5v2和CYP82E10敲除載體及三個(gè)基因共同的敲除載體。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將敲除載體分別轉(zhuǎn)化栽培煙草白肋煙TN90、紅花大金元及K326，通過抗性篩選獲得T0代陽性轉(zhuǎn)基因苗，并套袋自交收種子，播種到卡那抗性MS培養(yǎng)基上篩選獲得T1代陽性轉(zhuǎn)基因苗。通過檢測T0代或

5、T1代陽性轉(zhuǎn)基因苗煙堿去甲基化酶基因敲除靶位點(diǎn)序列，篩選得到敲除植株。其中白肋煙T1代獲得純合敲除植株CYP82E42株、CYP82E5v26株及CYP82E105株；紅花大金元 T0代敲除植株 CYP82E45株、CYP82E5v22株、CYP82E101株，以及CYP82E4和CYP82E10雙敲植株1株；K326 T0代敲除植株CYP82E43株、CYP82E5v24株及CYP82E101株。另外，白肋煙T1代CYP82E4基因純

6、合敲除植株自交獲得T2代純合敲除植株6株。③對移栽后62天的白肋煙T1/T2代純合敲除植株及野生型對照進(jìn)行農(nóng)藝性狀測定，結(jié)果表明：敲除株系與野生型白肋煙成熟期生長狀況基本一致，煙堿去甲基化酶基因的敲除對煙草生長沒有負(fù)面影響，甚至 cyp82e4的莖圍、葉面積以及cyp82e5v2的葉面積顯著高于野生型對照。用0.2%乙烯利處理白肋煙T1代敲除植株及野生型植株成熟期離體葉片，使其變黃，模擬煙草葉片的衰老過程。利用GC-MS方法測定處理過的