1、DNA甲基化是最主要的表觀遺傳方式之一。生物體中基因表達(dá)、蛋白質(zhì)相互作用以及腫瘤的產(chǎn)生發(fā)展等與 DNA甲基化水平和 DNA甲基化酶活性密切相關(guān)。發(fā)展簡(jiǎn)便、靈敏的甲基化酶檢測(cè)新方法對(duì)于生化分析和臨床相關(guān)疾病的診斷研究具有重要意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）檢測(cè)甲基化酶活性。設(shè)計(jì)了無(wú)標(biāo)記的發(fā)夾探針，該發(fā)夾探針的莖部有 Dam甲基化酶的特異識(shí)別序列。當(dāng)溶液中存在甲基化酶時(shí)，發(fā)夾探針被甲基化。然后加入限

2、制性內(nèi)切酶特異切割發(fā)夾探針，釋放出來(lái)的環(huán)部序列可作為引物引發(fā) EXPAR反應(yīng)。當(dāng)無(wú)甲基化酶時(shí)，發(fā)夾探針未被切斷，不能引發(fā) EXPAR反應(yīng)。最后，EXPAR反應(yīng)產(chǎn)物利用 DNA特異熒光染料直接檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了甲基化酶活性的測(cè)定。方法簡(jiǎn)便、快速、成本低，并可實(shí)現(xiàn)抑制甲基化酶活性的藥物篩選，為抗癌藥物的篩選提供了一種新方法。⑵滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合水溶性陽(yáng)離子共軛聚合物均相檢測(cè)甲基化酶活性的研究。我們新設(shè)計(jì)發(fā)夾探針，其在甲基化酶作用下，莖部的酶識(shí)別序列

3、被甲基化。再經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，釋放的序列將作為引物引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（RCA）。在擴(kuò)增過(guò)程中，我們加入熒光素修飾的dUTP（ dUTP-FITC），它隨擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行而添加到DNA產(chǎn)物中。當(dāng)加入PFP后，DNA與PFP通過(guò)靜電力結(jié)合拉近熒光素與PFP之間的距離，并發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。當(dāng)無(wú)甲基化酶時(shí)，該發(fā)夾探針結(jié)構(gòu)保持完整，不會(huì)引發(fā)RCA。溶液中游離的dUTP-FITC經(jīng)堿性磷酸酶降解，降解產(chǎn)物與PFP相互作用很小，