1、目的：探討瘦素（Leptin）促人乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3的M2型丙酮酸激酶（M2-pyruvate kinase，PKM2）表達及其誘導上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用及機制，初步闡明Leptin通過上調(diào)糖代謝關鍵酶PKM2而影響乳腺癌EMT及其作用機制。
　　方法：⑴采用蛋白質(zhì)印記法（ western blotting, WB）和免疫熒光法（ immun

2、ofluorescence, IF）檢測人乳腺癌細胞 MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468中Leptin長受體OB-Rb、短受體OB-Rt的表達；采用人源Leptin處理三株細胞，觀察細胞形態(tài)變化；WB檢測細胞EMT相關標志蛋白的表達。⑵Leptin處理人乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3后，采用QRT-PCR和WB，分析PKM2mRNA及蛋白水平的變化。⑶采用化學合成的PKM2-siRNA干擾乳腺癌細胞 MCF-7、SK

3、-BR-3的PKM2，劃痕及Transwell侵襲實驗分別檢測Leptin對兩株細胞遷移及侵襲能力的影響；WB檢測Leptin對兩株細胞EMT相關標志蛋白表達的影響。⑷采用Leptin聯(lián)合PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK/ERK1/2信號通路抑制劑處理乳腺癌細胞MCF-7和SK-BR-3，WB檢測PKM2的表達。采用Leptin受體中和抗體處理乳腺癌細胞MCF-7和SK-BR-3后， WB檢測Leptin對PKM2表達及對P

4、I3K/AKT信號通路激活的影響；采用 WB檢測 PI3K/AKT通路抑制劑處理后，乳腺癌細胞 MCF-7和SK-BR-3中 PKM2及EMT相關蛋白的表達。⑸構建穩(wěn)定干擾PKM2的乳腺癌SK-BR-3細胞株，利用該細胞株建立裸鼠移植瘤模型，測量腫瘤大小，觀察裸鼠生存期。免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測腫瘤組織EMT相關蛋白的表達，HE染色檢測腫瘤肝肺轉移。
　　結果：①WB及IF結果表明，乳

5、腺癌細胞 MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-468均表達OB-Rb和OB-Rt；Leptin能引起三株細胞形態(tài)發(fā)生EMT樣改變，且下調(diào)上皮性標志物E-cadherin，上調(diào)間質(zhì)性標志物Vimentin和Fibronectin的表達。②QRT-PCR及WB結果顯示，Leptin能顯著上調(diào)MCF-7、SK-BR-3細胞PKM2的mRNA及蛋白水平。③為進一步探討PKM2在Leptin促乳腺癌細胞EMT過程中的作用，采用PKM2-si

6、RNA干擾細胞表達PKM2，劃痕及Transwell實驗結果表明，MCF-7、SK-BR-3細胞的遷移和侵襲能力被抑制；WB檢測提示，細胞的E-cadherin水平升高，Vimentin、Fibronectin水平降低，即干擾細胞PKM2表達后Leptin促EMT作用被抑制。④WB結果表明，抑制PI3K/AKT信號通路能減弱Leptin促PKM2表達的作用。采用中和性抗體封閉Leptin受體OBR，PI3K/AKT信號通路的激活被抑制，

7、Leptin促 PKM2表達的作用也被抑制。采用 WB檢測發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路抑制后，Leptin促乳腺癌細胞PKM2表達及EMT的作用被抑制。⑤裸鼠乳腺癌移植瘤模型分為 SKBR-3、SKBR-3-LV和SKBR-3-shPKM2組，其中 SKBR-3、SKBR-3-LV為對照組， SKBR-3-shPKM2為實驗組。實驗結果表明SKBR-3-shPKM2組腫瘤體積、重量均明顯小于對照組。HE染色SKBR-3、SKBR-3-L

8、V組肝肺轉移灶較SKBR-3-shPKM2組明顯增多。瘤組織IHC結果顯示，與對照組相比，SKBR-3-shPKM2組 E-cadherin表達明顯升高，Vimentin、Fibronectin表達明顯降低，SKBR-3-shPKM2組小鼠生存期明顯延長。
　　結論：⑴Leptin促進乳腺癌細胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468發(fā)生EMT。⑵Leptin激活 PI3K/AKT信號通路上調(diào)乳腺癌細胞 MCF-7、SK-