1、缺血性心臟病是導(dǎo)致人類死亡的重要原因，探索對(duì)抗缺血受損心肌的保護(hù)方法及其機(jī)制是心血管領(lǐng)域的一個(gè)研究重點(diǎn)與熱點(diǎn)，具有十分重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。
　　缺血性心臟病及其術(shù)后并發(fā)癥（如再灌注損傷）存在不同程度的心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusioninjury，IRI）的主要病理機(jī)制之一，它與心肌IRI的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量決定心肌損傷的程度，嚴(yán)重時(shí)可引起心功能障礙，甚至

2、心功能衰竭。在缺血再灌注時(shí)，通過抑制心肌細(xì)胞凋亡可以顯著縮小心肌梗死面積和有效減少心功能紊亂的發(fā)生。
　　研究表明，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)血管新生，改善心肌血供，對(duì)抗心肌壞死和凋亡，對(duì)缺血心肌具有較好的保護(hù)作用，可為對(duì)抗缺血引起的心肌損傷提供新思路。FGFs是具有22個(gè)成員的肝素生長(zhǎng)因子家族，其中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（Fibroblast g

3、rowth factor-2，F(xiàn)GF-2，又稱堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic Fibroblast growth factor,bFGF））的作用倍受關(guān)注。FGF-2是多功能生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和遷移，具有強(qiáng)大的促血管新生作用。研究表明，F(xiàn)GF-2是一種重要的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)，具有明顯的心肌保護(hù)作用。本課題組和其他研究者的實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)GF-2對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用與其結(jié)合FGF受體1（FGFR1），激活蛋白激酶C（prot

4、ein kinase C，PKC）及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPKs）等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)。但PKC和MAPKs種類的多樣性及其亞類功能的不一致性使得這兩類蛋白激酶在介導(dǎo)FGF-2引起的心肌保護(hù)作用中情況變的復(fù)雜，而且FGF-2的心肌保護(hù)效應(yīng)也難以完全用PKC、MAPKs的激活來解釋。因此，尋找FGF-2心肌保護(hù)作用的其它機(jī)制顯得十分必要和重要。
　　糖原合成酶激酶

5、-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）是一種在體內(nèi)廣泛表達(dá)的多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶。GSK-3可分布在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核，而線粒體和細(xì)胞核中GSK-3活性要比細(xì)胞胞漿中的更高。人的GSK-3具有GSK-3α和GSK-3β2個(gè)亞型。GSK-3α/β分別存在與其功能密切相關(guān)的2個(gè)非常重要的磷酸化位點(diǎn)——Tyr279/Tyr216和Ser21/Ser9。在細(xì)胞靜息狀態(tài)時(shí)，以Tyr279/Tyr216

6、磷酸化為主，使GSK-3α/β保持激活狀態(tài)，如Ser21/Ser9發(fā)生磷酸化，則抑制GSK-3α/β活性。大量的研究顯示，GSK-3β在心肌保護(hù)中具有非常重要的意義。各類具有心肌保護(hù)作用的信號(hào)通路匯聚于GSK-3β，使GSK-3βSer9磷酸化，抑制GSK-3β活性，從而縮小心肌梗死面積，拮抗心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能，對(duì)抗心率失常，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。
　　酪氨酸激酶受體FGFR1激活后，通常會(huì)激活PLC-PKC，Ras-MAPKs

7、和PI3K-PKB/Akt信號(hào)通路。研究表明，PI3K-Akt/PKB-GSK-3β信號(hào)通路在心肌保護(hù)中扮演重要角色。心肌缺血預(yù)處理（Ischemic preconditioning，IPC）、心肌缺血后處理（Ischemic postconditioning，IPostC）、硫化氫及一些藥物的抗心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）作用都與激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路

8、有關(guān)。文獻(xiàn)表明：FGF-2可以通過激活PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路，拮抗慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡；促進(jìn)人胚神經(jīng)干細(xì)胞向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞分化；使前列腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）。PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路能否介導(dǎo)FGF-2的心肌保護(hù)作用？目前不清楚。
　　因此，本研究提出“FGF-2可能通過激活PI3K-PK

9、B/Akt-GSK-3β信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用”的科學(xué)假設(shè)。為驗(yàn)證這一假設(shè)，首先采用大鼠離體心臟缺血/再灌損傷模型和心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察FGF-2對(duì)心肌梗死面積、心功能和心肌細(xì)胞凋亡的影響及PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路的變化；然后采用心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，探索GSK-3β如何介導(dǎo)FGF-2抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。通過這些研究，旨在揭示FGF-2心肌保護(hù)作用的新機(jī)制和新途徑，進(jìn)一步闡明這一重要的內(nèi)源性細(xì)

10、胞保護(hù)物質(zhì)的生理與病理意義，為缺血性心臟病的治療提供新思路和新的干預(yù)環(huán)節(jié)。
　　第一部分、FGF-2心肌保護(hù)作用的新機(jī)制探索
　　PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路的作用
　　目的：探索PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路在FGF-2心肌保護(hù)中的作用。
　　方法：
　　1．觀察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路在FGF-2對(duì)抗大鼠離體心臟IRI的作用。利用 Langendo

11、rff心臟灌流系統(tǒng)建立大鼠離體心臟缺血再灌注損傷（IRI）模型，47只SD大鼠隨機(jī)分為7組，每組6～7只：①缺血再灌注組（I/R）：K-H液灌流平衡30min，接著K-H液再灌流5分鐘，停灌30分鐘，復(fù)灌60分鐘；②I/R+LY294002組（LY294002）：在I/R的基礎(chǔ)上，在停灌前5分鐘和復(fù)灌的全程使用含有15μM的PI3K特異性抑制劑LY294002 K-H液灌流；③I/R+SH-5組（SH-5）：在I/R的基礎(chǔ)上，給予含有1

12、0μM PKB/Akt抑制劑SH-5的K-H液灌流，SH-5的使用方式與LY294002相同；④I/R+SB216763組（SB216763）：在I/R的基礎(chǔ)上，在再灌注前5分鐘和整個(gè)再灌注內(nèi)給予含有3μM GSK-3β抑制劑SB216763的K-H液灌流；⑤I/R+FGF-2組（FGF-2）：在I/R的基礎(chǔ)上，在復(fù)灌最初10分鐘給予含有FGF-2（10μ g/heart）K-H液灌流；⑥ I/R+FGF-2+LY294002組（FGF

13、-2+LY294002）：FGF-2與LY294002分別按FGF-2組和LY294002組的方式與劑量給與；⑦I/R+FGF-2+SH-5組（FGF-2+SH-5）：FGF-2與SH-5分別按FGF-2組和SH-5組的方式與劑量給與。采用1％氯化三苯基四氯唑（TTC）染色檢測(cè)心肌梗死面積；全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定冠脈流出液LDH活性；生物信息采集系統(tǒng)記錄左心室收縮壓（ LVSP）、左心室舒張壓（LVDP）、左室內(nèi)壓最大變化速率（dp/dt

14、max）；TUNEL結(jié)合DAPI染色檢測(cè)心肌組織細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)各組Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白水平。
　　2．觀察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路在FGF-2對(duì)抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷的作用。
　?。?）觀察FGF-2對(duì)正常心肌細(xì)胞Akt和GSK-3β活性的影響。用10ng/m

15、lFGF-2分別處理H9c2心肌細(xì)胞0、5、10、20、30、60分鐘，采用Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt(Ser473)、GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)。
　?。?）觀察H/R對(duì)心肌細(xì)胞損傷及Akt與GSK-3β活性的影響。首先將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組；②缺氧90分鐘組；③缺氧90分鐘，復(fù)氧120分鐘組。采用CCK-8比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率。然后將H9c2心肌細(xì)胞依次缺

16、氧0、0.5、1、2小時(shí)，在缺氧2小時(shí)的基礎(chǔ)上，再依次復(fù)氧0.5、1、2、12和24小時(shí)，Western blot分別檢測(cè)Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表達(dá)水平。
　?。?）觀察FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞損傷及Akt與GSK-3β活性的影響。
　　H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組；②H/R組；③H/R+FGF-2組。采用CCK-8比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；We

17、stern blot分別檢測(cè)Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β的表達(dá)水平。
　　（4）觀察PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路在FGF-2對(duì)抗H/R所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的作用。首先，將體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組（ Control）；②H/R組；③H/R+FGF-2組（ FGF-2）；④H/R+FGF-2+LY294002組（FGF-2+LY294002）；⑤H/R+FGF-2+ SH-5組

18、（FGF-2+SH-5）。以含10ng/ml FGF-2的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞30分鐘后，缺氧90分鐘，復(fù)氧120分鐘，其中10μmol/L LY294002或5μmol/L SH-5在缺氧前1小時(shí)加入。復(fù)氧結(jié)束后，采用CCK-8比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率；TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；采用Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt、GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達(dá)。然后，觀察GSK-3β-WT、具有較高激酶活性

19、的GSK-3β-S9A突變體和激酶活性喪失的GSK-3β-K85R突變體對(duì)心肌細(xì)胞GSK-3β和p-GSK-3β蛋白表達(dá)的影響。將V5Tag標(biāo)記的pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-S9A、pcDNA3/GSK-3β-K85R質(zhì)粒擴(kuò)增，抽提和測(cè)序。接著將pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-S9A和pcDNA3/GSK-3β-K85R分別轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用West

20、ern blot檢測(cè)各組細(xì)胞V5Tag的表達(dá)水平。隨后實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組（Con）；②空載體組（Vec）；③GSK-3β-WT組（WT）；④GSK-3β-S9A組（S9A）；⑤GSK-3β-K85R組（K85R）。采用Western blot方法檢測(cè)GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)。最后，觀察FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的影響。將GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A突變體和GSK-3β-K85R突變

21、體成功轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：①正常組（Control）；②H/R組；③H/R+ GSK-3β-K85R組（H/R+K85R）；④H/R+GSK-3β-S9A組（H/R+S9A）；⑤H/R+FGF-2組；⑥H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2組（H/R+S9A+FGF-2）。采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞胞漿和線粒體中Bax蛋白表達(dá)，Bcl-2、32KD Caspase-3和17KD Caspase-3蛋白表達(dá)。
　　結(jié)

22、果：
　　1．離體心臟灌流研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)灌時(shí)給予FGF-2，心肌梗死面積較缺血再灌注組減少42.3%（P<0.01），冠脈流出液中LDH活性降低32.8%（P<0.01），LVSP增加25.8%，LVDP增加38.5%，dp/dtmax絕對(duì)值分別增加35.9%和52.0%（均P<0.01），心肌細(xì)胞AI（apoptosis index）降低52.3%（P<0.01），p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分別增加1

23、12.5%和112.1%(均 P<0.01)。PI3K特異性抑制劑LY294002和PKB/Akt抑制劑SH-5可以對(duì)抗FGF-2的心肌保護(hù)作用，F(xiàn)GF-2+LY294002組心肌梗死面積較FGF-2組增加40.2%（P<0.05），冠脈流出液中LDH活性增加25.6%（P<0.05），LVSP降低12.6%，LVDP降低17.2%，dp/dtmax絕對(duì)值分別降低13.9%和22.4%（均P<0.05），p-Akt/Akt、p-GSK-

24、3β/GSK-3β比值分別下降27.7%和27%(均P<0.05)；FGF-2+SH-5組心肌梗死面積較FGF-2組增加29.5%（P<0.05），冠脈流出液中LDH活性升高20.0%（P<0.05），LVSP降低10.1%，LVDP降低13.4%，dp/dtmax絕對(duì)值分別下降9.9%和17.5%（均P<0.05），p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β比值分別降低19.2%和20.3%(均P<0.05)。在復(fù)灌時(shí)給予GS

25、K3β抑制劑SB216763，心肌梗死面積較缺血再灌注組減少43.6%（P<0.01），冠脈流出液中LDH活性降低41.1%（P<0.01），LVSP增加29.9%，LVDP增加46.6%，dp/dtmax絕對(duì)值分別增加40.7%和58.7%（均P<0.01），p-GSK-3β/GSK-3β比值增加129.2%(P<0.01)。與缺血再灌注組相比，LY294002組和SH-5組心功能、心肌梗死面積、冠脈流出液中LDH活性、p-Akt/A

26、kt、p-GSK-3β/GSK-3β比值變化無顯著差異（均P＞0.05）。
　　2．缺氧和H/R可以抑制心肌細(xì)胞活力（與正常組相比，P<0.01）。FGF-2可以明顯提高H/R心肌細(xì)胞存活率，拮抗H/R所誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡（與H/R組相比，所有P<0.05）；LY294002和SH-5可以對(duì)抗FGF-2的以上作用（與FGF-2組相比，所有P<0.05）。
　　3．在正常心肌細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-2可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Akt和G

27、SK-3β的活性；缺氧可以短暫性激活A(yù)kt，H/R先激活后抑制Akt的活性；缺氧可以短暫性抑制GSK-3β的活性，H/R先抑制后激活GSK-3β；FGF-2顯著促進(jìn)H/R心肌細(xì)胞p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達(dá)（與H/R組相比，所有P<0.01），其作用能被LY294002或SH-5拮抗（與FGF-2組相比，所有P<0.05）。
　　4．測(cè)序結(jié)果顯示，GSK-3β-WT基因序列是正確的，GSK-3β-S9A突變體的9位絲氨酸確

28、實(shí)被丙氨酸取代，GSK-3β-K85R突變體的85位賴氨酸確實(shí)被精氨酸取代；本實(shí)驗(yàn)所采用的方法可以將GSK-3β-WT、GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R有效轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞；GSK-3β-WT組、GSK-3β-S9A組和GSK-3β-K85R組p-GSK-3β/GSK-3β比值明顯降低，以GSK-3β-S9A組最低（與空白對(duì)照組相比，P<0.05）。
　　5．H/R促進(jìn)Bax由細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)入線粒體，激活Caspase-3及抑

29、制Bcl-2蛋白的表達(dá)（與正常組相比，P<0.05）；FGF-2和GSK-3β-K85R突變體可以抑制H/R的以上作用（與H/R組相比，P<0.05）；GSK-3β-S9A突變體可以逆轉(zhuǎn)FGF-2對(duì)H/R的抑制作用（與H/R+FGF-2組相比，P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．FGF-2能拮抗大鼠心肌I/R損傷和心肌細(xì)胞H/R損傷，具有良好的心肌保護(hù)作用；
　　2．PI3K-PKB/Akt-GSK-3β信號(hào)通路的激

30、活介導(dǎo) FGF-2拮抗的大鼠心肌I/R損傷和心肌細(xì)胞H/R損傷，是FGF-2心肌保護(hù)作用新的分子機(jī)制。
　　第二部分、線粒體GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌細(xì)胞凋亡中的作用
　　目的：探索GSK-3β介導(dǎo)FGF-2抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法：
　　1．觀察GSK-3β在 H/R心肌細(xì)胞凋亡中的作用。H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組（Normal）；②H/R組；③H/R+Control s

31、iRNA組（Control siRNA）；④H/R+GSK-3βsiRNA組（GSK-3βsiRNA）；⑤H/R+SB216763組（SB216763）。心肌細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染GSK-3βsiRNA48小時(shí)后或預(yù)孵育3μM GSK3β選擇性抑制劑SB21676330分鐘后，接著缺氧90分鐘，復(fù)氧120分鐘。復(fù)氧結(jié)束后，采用TUNEL結(jié)合DAPI染色檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況。
　　2．觀察GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2對(duì)抗H

32、/R心肌細(xì)胞凋亡中的作用。將GSK-3β-S9A和GSK-3β-K85R質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組：①正常組（Normal）；② H/R組；③H/R+GSK-3β-K85R組（GSK-3β-K85R）；④H/R+ GSK-3β-S9A組（GSK-3β-S9A）；⑤H/R+FGF-2組（FGF-2）；⑥H/R+GSK-3β-S9A+FGF-2組（GSK-3β-S9A+ FGF-2）。采用TUNEL結(jié)合DAPI染色檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情

33、況。
　　3．觀察FGF-2對(duì)線粒體p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響。首先，觀察FGF-2對(duì)細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)的影響。心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組（Vehicle）；②FGF-2組。采用免疫熒光檢測(cè)GSK-3β蛋白表達(dá)。接著，觀察FGF-2對(duì)細(xì)胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響。心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組（Vehicle）；②LY294002組；③FGF-2組；④FGF-2+LY294002組。采用免疫熒光

34、檢測(cè)p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)。最后， 觀察 FGF-2對(duì)線粒體和細(xì)胞胞漿GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響。心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組（Vehicle）；②FGF-2組。采用Western blot檢測(cè)線粒體和細(xì)胞胞漿中GSK-3β和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)。
　　4．觀察GSK-3βsiRNA對(duì)H/R心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為：①正常組；②H/

35、R組；③H/R+GSK-3βsiRNA組。采用Western blot檢測(cè)Bcl-2、細(xì)胞胞漿和線粒體Bax蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．GSK-3βsiRNA和SB216763可以拮抗H/R心肌細(xì)胞凋亡（與H/R組相比，P<0.05）。
　　2．FGF-2和GSK-3β-K85R突變體抑制心肌細(xì)胞凋亡（與H/R組相比，P<0.05），GSK-3β-S9A突變體逆轉(zhuǎn)FGF-2對(duì)H/R心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用（與H/R+

36、FGF-2組相比，P<0.05）。
　　3．FGF-2對(duì)心肌細(xì)胞GSK-3β蛋白表達(dá)無影響，F(xiàn)GF-2促進(jìn)心肌細(xì)胞p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)，而且主要以線粒體p-GSK-3β(Ser9)表達(dá)為主。
　　4．GSK-3βsiRNA可以減輕H/R對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用，阻止Bax由細(xì)胞胞漿轉(zhuǎn)入線粒體（與H/R組相比，P<0.05）。
　　結(jié)論：線粒體GSK-3β蛋白Ser9的磷酸化在FGF-2抗心肌細(xì)胞凋