1、【研究背景】肺動脈高壓(PH)是多種病因導致的肺動脈血管床破壞，血管重構，循環(huán)阻力增加，從而導致右心壓力負荷增高，進而導致右心衰竭的綜合征。是多種循環(huán)、呼吸、代謝等系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理過程。肺動脈高壓患者約75％在診斷后5年內死亡，癥狀出現(xiàn)后平均生存期約1.9年；有右心衰表現(xiàn)者，平均生存時間小于1年。肺動脈高壓危害大，預后差。其肺血管的基本病理變化，早期以肺動脈收縮為主，后期以肺動脈重塑為主。目前，關于肺動脈高壓的發(fā)病機制尚

2、不完全清楚。研究表明，肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)內鈣離子濃度（[Ca2+]i）在肺動脈高壓發(fā)病過程中扮演重要的角色。細胞內Ca2+與鈣調蛋白（CaM）結合，形成Ca2+-CaM復合物，該復合物結合胞質內的肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），并使之活化?；罨腗LCK磷酸化粗肌絲原肌球蛋白橫橋的肌球蛋白輕鏈（MLC），磷酸化的MLC（P-MLC）激活橫橋的ATP酶，水解ATP釋放能量引發(fā)肌絲滑動，導致平滑肌收縮。細胞內Ca2+還可激活鈣依

3、賴激酶（如鈣調蛋白激酶，CaMK）和某些轉錄因子[如c-Fos，激活的T細胞的核因子(NFAT), cAMP反應元件結合蛋白(CREB)]等，促使休眠期細胞進入增殖期，引起PASMCs增殖。
　　細胞內鈣離子濃度的升高通常通過以下途徑實現(xiàn)：1）細胞內細胞器（如肌質網(wǎng)）儲存鈣的釋放；2）細胞膜鈣 ATP酶（Ca2+-ATPases）及鈉鈣交換體（Na+/Ca2+ exchangers）介導的細胞外液鈣離子內流；3）細胞膜鈣離子通道介

4、導的細胞外液鈣離子內流。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細胞膜鈣離子通道主要有受體操縱性鈣通道（ROCCs）、電壓依賴性鈣通道（VDCCs）和鈣池操縱性鈣通道（SOCCs）。本課題組及其他學者的研究發(fā)現(xiàn)，在低氧誘導的[Ca2+]i升高過程中，SOCC而不是VDCC起主導作用。
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）是細胞內蛋白質降解的主要途徑，該途徑包括底物蛋白質的泛素化和蛋白酶體降解兩個過程。底物蛋白質

5、經(jīng)泛素活化酶E1、泛素載體蛋白E2、泛素連接酶E3的催化作用而被多聚泛素化。多聚泛素鏈作為一種標簽，可以被26S蛋白酶體識別，進而被26S蛋白酶體降解。研究表明，在多種疾病尤其是增生性疾病，存在蛋白酶體活性增強。作為一個新的治療靶點26S蛋白酶體受到廣泛關注。硼替佐米（BTZ）是第一個用于臨床的蛋白酶體抑制劑，用于治療多發(fā)性骨髓瘤取得了良好的療效。近年來，有研究表明BTZ可明顯緩解動物模型肺動脈高壓的進展。其機制可能與上調內皮源性一氧化

6、氮合酶（eNOS)，促進一氧化氮（NO）磷酸化，進而增加NO的合成以及上調核因子-jB抑制物(I-κBα)等有關。BTZ下調核因子-κB（NF-κB)，轉化生長因子-β（TGF-β)和血管內皮生長因子（VEGF)的作用，也有助于肺動脈高壓的治療。
　　BTZ緩解模型動物肺動脈高壓的作用是否與其調節(jié)PASMCs內鈣離子穩(wěn)態(tài)有關，尚未發(fā)現(xiàn)相關研究。本文擬通過BTZ治療肺動脈高壓的具體作用及其對細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)的影響進一步探討B(tài)TZ治療

7、肺動脈高壓的機制。
　　【研究目的】探討蛋白酶體抑制劑硼替佐米（BTZ）治療低氧及野百合堿（MCT）誘導的肺動脈高壓大鼠模型的有效性及其可能的作用機制。
　　【研究方法】分別建立低氧和MCT誘導的大鼠肺動脈高壓模型，并予BTZ干預。21天后測定大鼠右心室壓力（RVP）、右心室肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]。4%多聚甲醛固定肺組織用于 HE染色。分離肺動脈，除去外膜及內膜組織，得到肺動脈平滑肌組織。取一部分用于培養(yǎng)PASMCs

8、。24-48h待細胞貼壁后，用鈣離子成像系統(tǒng)測定細胞內基礎鈣離子濃度及SOCE。另一部分提取RNA或蛋白，通過熒光定量PCR和免疫印跡法測定肺動脈HIF-1α、BMP4、PPARγ、TRPC1和 TRPC6的表達。
　　分離正常大鼠遠端肺動脈，原代培養(yǎng) PASMCs，通過 BrdU法測定不同濃度 BTZ對 PASMCs增殖的影響，并選擇一合適濃度及藥物作用時間進行細胞內基礎鈣離子濃度及SOCE的測定。并通過熒光定量PCR和免疫印跡

9、法測定原代培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細胞HIF-1α、BMP4、PPARγ、TRPC1和 TRPC6的表達情況。
　　【研究結果】成功建立慢性低氧誘導的肺動脈高壓（CHPH）大鼠模型及MCT誘導的肺動脈高壓大鼠模型（MCT-PH）。BTZ顯著降低肺動脈高壓大鼠模型的平均右心室壓、右心室收縮壓及右心室肥厚指數(shù)，減輕肺動脈血管壁增厚；BTZ在 mRNA及蛋白水平顯著抑制低氧及 MCT誘導的HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6表達上

10、調和PPARγ表達下調；BTZ顯著降低肺動脈高壓模型大鼠肺動脈平滑肌細胞內基礎鈣離子濃度及SOCE。
　　在體外原代培養(yǎng)的肺動脈平滑肌細胞，BTZ顯著抑制低氧誘導的原代肺動脈平滑肌細胞增殖，并呈劑量依賴性。BTZ在mRNA及蛋白水平顯著抑制低氧誘導HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6的表達上調和PPARγ的表達下調；BTZ顯著降低低氧肺動脈平滑肌細胞內基礎鈣離子濃度及SOCE。
　　【結論】BTZ能夠顯著改善低氧