1、肝素結(jié)合表皮生長因子（Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF）能結(jié)合肝素，是表皮生長因子家族中的一員，與表皮生長因子受體結(jié)合后，以旁分泌、自分泌、近分泌的形式發(fā)揮其生物活性。HB-EGF在很多生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，例如傷口愈合、胚胎植入、動脈粥樣硬化和心臟發(fā)育等。臨床實驗證明HB-EGF在乳腺癌和卵巢癌中過量表達，特異性抑制HB-EG

2、F及其下游信號通路后，腫瘤細胞的凋亡數(shù)增加，生長速度變慢，血管生成受到抑制，遷移侵潤速率變慢；且拮抗HB-EGF和抗癌藥物聯(lián)合用藥時，腫瘤的抗藥性大大降低，說明HB-EGF與乳腺癌和卵巢癌等腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和抗藥性有密切的關(guān)系。所以，開發(fā)特異性抑制HB-EGF的藥物可能會抑制相應癌癥的發(fā)生發(fā)展。
　　通過在噬菌體外殼蛋白基因中插入序列隨機的外源多肽編碼序列，多肽以融合蛋白的形式被展示在病毒的表面，這樣就使得病毒內(nèi)編碼外源多肽的基因

3、序列與病毒表面的多肽建立了直接聯(lián)系。體外噬菌體展示的流程是先將肽庫與固定的靶分子結(jié)合，洗去未結(jié)合的噬菌體，繼而將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來并通過轉(zhuǎn)染宿主菌進行擴增。三到五輪淘選之后，即可富集到與靶分子具有高親和力的噬菌體。多肽的DNA序列可以通過測序得知。
　　多肽藥物具有免疫原性低、分子量小和易吸收等優(yōu)點，所以本課題旨在通過噬菌體展示技術(shù)淘選到能特異性結(jié)合HB-EGF并能抑制其活性的多肽，從而為研發(fā)抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
　

4、　本課題首先利用PCR獲得sHB-EGF基因，經(jīng)雙酶切將目的基因?qū)朐吮磉_載體pET-30a后，重組載體被轉(zhuǎn)化進入宿主菌 BL21(DE3)，細菌經(jīng) IPTG誘導大量表達出sHB-EGF。經(jīng)鎳柱親和層析和肝素親和層析純化后我們得到大量純蛋白(His)6-sHB-EGF。為避免后續(xù)實驗中可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，我們用腸激酶去掉占全長重組蛋白53％的(His)6標簽，得到sHB-EGF蛋白。
　　我們以 sHB-EGF為靶分子，按照結(jié)合

5、-清洗-洗脫的流程進行了兩次體外噬菌體展示：分別用肝素鈉和 sHB-EGF配制洗脫液進行淘選，并最終獲得了三個候選多肽——TUZG1、2和3。后經(jīng)ELISA實驗證明：TUZG1、2和3都與sHB-EGF特異性結(jié)合。
　　細胞劃痕實驗和Transwell實驗證實，sHB-EGF具有促進卵巢癌細胞SKOV-3遷移和侵潤的作用。通過多肽生物學效應驗證實驗，我們發(fā)現(xiàn)：候選多肽TUZG3能顯著抑制sHB-EGF的促遷移和促侵潤作用，而TUZ

6、G1和TUZG2對sHB-EGF的促遷移和促侵潤作用沒有顯著影響。由于 TUZG1和 TUZG2是肝素鈉洗脫下來的多肽，我們因此推測其可能具有與肝素類似的抗凝血作用。經(jīng) APTT、試管法、剪尾法驗證 TUZG2確實具有與肝素類似的抗凝血活性。
　　綜上所述，我們通過分子克隆、原核表達、親和層析等方法，獲得了高純度靶分子sHB-EGF；利用噬菌體展示獲得了特異性結(jié)合 sHB-EGF的三條候選多肽；最后經(jīng)生物學效應驗證發(fā)現(xiàn)，TUZG3