1、 分類號 分類號 密 級 U D C 編 號 碩 士 學 位 論 文 口蝦蛄卵黃蛋白原基因 cDNA 全長 序列的克隆及表達分析 張娜 1222010 指導教師姓名 劉海映 教授 專 業(yè) 名 稱 漁業(yè)

2、資源 論文答辯日期 2015 年 6 月 3 日 學位授予日期 2015 年 6 月 日 摘要 I 摘要 口蝦蛄(Oratosquilla oratoria) 是我國沿海重要的海產經濟甲殼動物之一，是具有極高經濟價值的優(yōu)良品種。近年來由于過度捕撈和海區(qū)環(huán)境的破壞，致使其資源量減少，對其進行人工繁育和資源保護勢在必行，而進行人工繁育和資源保護的前提是了解其繁殖發(fā)育規(guī)律，這包括了解與繁殖

3、有關基因的時空表達模式。本研究以口蝦蛄繁殖發(fā)育中重要基因——卵黃蛋白原基因為研究對象，對其進行克隆和表達分析，以期豐富口蝦蛄繁殖生物學的研究內容，為全面了解口蝦蛄的繁殖規(guī)律，進而進行人工繁育和資源保護奠定重要基礎。 在動物繁殖發(fā)育中，卵黃蛋白原(Vitellogenin，Vg)是存在于非哺乳類卵生動物成熟雌性個體中的一種蛋白，是卵黃蛋白(Vitellin,Vn)的前體。卵黃是卵生動物卵巢以及卵中的主要物質，卵黃蛋白是構成卵黃的主要部分，

4、并在卵黃發(fā)生期迅速積累。在卵生動物中，Vg 不僅為成熟的卵母細胞發(fā)育成胚胎提供蛋白質、糖類、脂肪以及其他營養(yǎng)物質，還能結合金屬離子（例如 Zn2+ ,Fe3+,Cu2+,Mg2+,Ca2+）并作為載體攜帶它們進入到卵母細胞中。卵黃蛋白原在卵黃發(fā)生期能攜帶類胡蘿卜素、甲狀腺素、視黃醇、核黃素進入卵母細胞。此外，卵黃蛋白原還具有免疫防御功能。迄今為止甲殼類卵黃蛋白原的研究主要集中于十足目甲殼動物，尚未發(fā)現口足目口蝦蛄卵黃蛋白原的研究，考慮到

5、卵黃蛋白原在繁殖發(fā)育中的重要作用，對口蝦蛄的卵黃蛋白原基因進行克隆與表達分析顯得非常重要。 本實驗利用 cDNA 末端快速擴增技術（RACE）首次成功克隆獲得口蝦蛄(Oratosquilla oratoria)卵黃蛋白原（Vitellogenin，Vg）基因的 cDNA 全長序列。且應用相對實時熒光定量 PCR 技術首次檢測口蝦蛄卵巢不同發(fā)育時期 Vg 基因的表達量。序列分析結果表明：Vg 基因全長 7727 bp（GenBank 登陸

6、號：KR422400） ，其中 5’端非編碼區(qū) 36 bp，開放閱讀框（ORF）7521 bp，3’端非編碼區(qū) 170 bp，共編碼 2506 個氨基酸。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明,克隆所得口蝦蛄 Vg 基因和十足目蝦蟹類 Vg 基因親緣關系較近，符合甲殼動物的最新分類系統(tǒng)。其開放閱讀框編碼的氨基酸序列和其他已知十足目卵黃蛋白原序列在 NCBI上進行數據庫比對（BLASTP）存在 46%~52%的相似性，且含有 4 個已知功能結構域：參與脂質

7、轉運的卵黃蛋白原 N 端結構域（Vitellogenin_N）和脂蛋白（Lipoprotein）N 端結構域（LPD_N） ，以及 2 個血管性血友病因子（von Willebrand factor）D 型結構域（VWD） 。實時熒光定量 PCR 分析結果表明,口蝦蛄 Vg 基因的表達量隨著卵巢發(fā)育的進程顯著升高 （P <0.05） ，在成熟期時達到最高值，隨后顯著下降（P <0.05） ，未發(fā)育期時的表達量最低。由此可知，