1、目的:卵巢粒層細胞瘤是一種少見的卵巢性索-間質(zhì)腫瘤，約占卵巢惡性腫瘤的2-5％左右，按照其組織病理學(xué)類型可分為成年型及幼年型，其中以成人型最為多見，目前發(fā)生機制不明;粒層細胞瘤的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，主要為腹痛腹脹、內(nèi)分泌紊亂及腹部包塊，術(shù)前一般難以明確診斷，確診主要靠術(shù)后病理;鏡下形態(tài)復(fù)雜多樣，按腫瘤細胞的排列方式可以分為微濾泡型、小梁型、島狀型及彌漫型等，各種方式常以不同比例混合存在，為粒層細胞瘤的診斷及組織學(xué)分級造成困難;粒層細胞瘤

2、的診斷指標相對單一，主要為常規(guī)HE染色加免疫組織化學(xué)染色輔助，而現(xiàn)階段用于粒層細胞瘤診斷的一線免疫組化抗體如a-inhibin、CD99、calretinin、EMA、vimentin等的敏感性和特異性均難以滿足日常工作的需要;在治療和預(yù)后方面，粒層細胞瘤具有低度惡性、遠期復(fù)發(fā)的特性，迄今為止尚無充分的證據(jù)表明放化療能延緩或預(yù)防其復(fù)發(fā)。近年來，表觀遺傳學(xué)的發(fā)展突飛猛進，表觀調(diào)控異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系亦成為新的研究熱點。表觀調(diào)控異常是指

3、不發(fā)生DNA序列變化的基因表達的改變，主要包括DNA甲基化及組蛋白甲基化。越來越多的研究顯示，抑癌基因啟動子甲基化及組蛋白甲基化可以沉默相應(yīng)抑癌基因的表達，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用;研究同時發(fā)現(xiàn)DNA甲基化及組蛋白甲基化均具有可逆轉(zhuǎn)特性，去甲基化處理可以重新激活沉默的抑癌基因的表達，發(fā)揮抑癌功能，從而使甲基化酶抑制劑類藥物的研究成為抗腫瘤治療的新思路。本課題擬通過對卵巢粒層細胞瘤(Ovary.Granulosa CellTumo

4、rs，GCTs)中抑癌基因啟動子甲基化及組蛋白甲基化狀況的研究，為粒層細胞瘤的發(fā)生機制、診斷及治療尋找新的研究靶點。
　　方法:(1)收集2010-2013年間齊魯醫(yī)院及單縣中心醫(yī)院成人型卵巢粒層細胞瘤共30例作為研究對象（年齡23-71歲，中位年齡50歲），同時收集卵巢濾泡囊腫30例作為對照，其中五例為上述粒層細胞瘤合并的對側(cè)卵巢濾泡囊腫，另25例為同時期同年齡段因子宮肌瘤等病變手術(shù)時切除的卵巢濾泡囊腫。(2)所用病例均經(jīng)齊魯醫(yī)

5、院病理科兩名高級職稱專家雙盲復(fù)審閱片，證實診斷準確可靠，同時挑選出合適的組織蠟塊。(3)收集所有粒層細胞瘤患者的臨床病理指標，包括年齡、腫瘤大小、FIGO分期、有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。(4)運用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)檢測30例卵巢粒層細胞瘤組織標本及30例卵巢濾泡囊腫組織標本中3個抑癌基因(tumor supper-ssor genes，TSGs) CDH13，DKK3，F(xiàn)OXL2啟動子的甲

6、基化狀態(tài)。(5)采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemi-stry，IHC)兩步法檢測組蛋白甲基化酶EZH2蛋白在卵巢粒層細胞瘤及濾泡囊腫標本中的表達狀況。(6)利用Fisher's確切概率法分析抑癌基因(CDH13，DKK3，F(xiàn)OXL2)甲基化與卵巢粒層細胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性。(7)利用Fisher's確切概率法分析組蛋白甲基化酶EZH2的表達與卵巢粒層細胞瘤臨床病理特征的相關(guān)性。(8)利用X2檢驗法分析抑癌基因(CDH

7、13，DKK3，F(xiàn)OXL2)甲基化率與組蛋白甲基化酶EZH2表達率的相關(guān)性。(9)從上述30例粒層細胞瘤中隨機挑選出10例，利用巢氏PCR法對10例粒層細胞瘤進行SNP檢測，檢測CDH13，DKK3外顯子及FOXL2突變熱點C134W基因序列有無改變。
　　結(jié)果:(1)在30例卵巢粒層細胞瘤中三個抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率分別為86.67％、80％和70％，顯著高于濾泡囊腫（分別為23.33％、26.67％

8、和20％），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，均顯示p＜0.01。(2)30例卵巢粒層細胞瘤中11例EZH2蛋白呈陽性表達（陽性率為36.7％），而30例濾泡囊腫組織均呈陰性（陽性率為0％），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，p＜0.01。(3)本組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)粒層細胞瘤中三個抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化與臨床病理指標間（年齡、腫瘤大小、FIGO分期及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況）存在統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P＞0.05)。(4)本組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)粒層細胞瘤中組蛋白甲基化酶E

9、ZH2的表達與臨床病理指標間（年齡、腫瘤大小、FIGO分期及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)情況）存在統(tǒng)計學(xué)的相關(guān)性(P＞0.05)。(5)本組數(shù)據(jù)未發(fā)現(xiàn)卵巢粒層細胞瘤中抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2的甲基化率與組蛋白甲基化酶EZH2的表達率之間存在統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(P＞0.05)。(6)10例粒層細胞瘤中，CDH13全部外顯子未發(fā)現(xiàn)有集中突變點，僅個別病例在二、五、九號外顯子檢測到散在的突變點;(7)10例粒層細胞瘤中有4例在DKK3基因七號外顯子檢測

10、到A--＞G突變;10例粒層細胞瘤均發(fā)現(xiàn)在FOXL2-C134W位點存在C--＞G突變。
　　結(jié)論:(1)三個抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2啟動子甲基化率均達到70％及以上，并顯著高于卵巢濾泡囊腫，提示三者的甲基化在卵巢粒層細胞瘤中屬于頻發(fā)事件，推測其在卵巢粒層細胞瘤的發(fā)生中具有重要作用，可以作為粒層細胞瘤敏感性較強的診斷性指標。(2)粒層細胞瘤中組蛋白甲基化酶ZEH2的表達率雖低于抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL

11、2的甲基化率，但顯著高于其在濾泡囊腫中的表達率，且在全部30例濾泡囊腫中失表達，提示組蛋白甲基化可能在粒層細胞瘤的發(fā)生中發(fā)揮一定作用;同時提示其作為粒層細胞瘤診斷性指標，敏感性較差，而特異性較高，可以和CDH13，DKK3及FOXL2甲基化聯(lián)合應(yīng)用，提高卵巢粒層細胞瘤診斷率。(3)本課題未發(fā)現(xiàn)抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2啟動子甲基化及組蛋白甲基化酶EZH2的表達率與粒層細胞瘤的臨床病理指標存在相關(guān)性，提示CDH13，DKK3

12、和FOXL2啟動子甲基化及組蛋白甲基化可能是卵巢粒層細胞瘤發(fā)生的早期事件，與其發(fā)生有關(guān)，而與其進展及預(yù)后無關(guān);亦可能與粒層細胞瘤自身低度惡性、進展緩慢和遠期復(fù)發(fā)的特性有關(guān)，需要進行長期隨訪進一步研究分析;抑或與本課題研究樣本小有關(guān)，需要有大樣本的研究進一步探討。(4)組蛋白有多種不同的甲基化模式，EZH2可靶向催化H3K27發(fā)生三甲基化，并進一步發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生的作用。本課題未發(fā)現(xiàn)粒層細胞瘤中抑癌基因CDH13，DKK3和FOXL2啟動

13、子甲基化率與組蛋白甲基化酶EZH2表達率之間存在統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，DNA甲基化與組蛋白H3K27甲基化之間可能不存在交互作用。提示在粒層細胞瘤中，某些抑癌基因的甲基化與組蛋白的某種類型甲基化可能通過各自的途徑沉默抑癌基因的表達，促進粒層細胞瘤的發(fā)生。(5)本課題在10粒層細胞瘤中未檢測到CDH13的十四個外顯子存在集中突變點，僅個別病例在個別外顯子檢測到散在突變點，提示CDH13啟動子甲基化可能單獨起作用，不改變基因序列而沉默相關(guān)基因的表達

14、，降低相關(guān)蛋白水平，促進腫瘤的發(fā)生。逆轉(zhuǎn)啟動子的甲基化則可能重新啟動CDH13的表達活性，使相應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄量及蛋白水平顯著增加，發(fā)揮抑癌作用。(6)10例粒層細胞瘤中有4例在DKK3基因七號外顯子檢測到A--＞G突變，文獻中尚未見報道，可以經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯造成相應(yīng)的氨基酸由精氨酸R轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼酖，有可能因此而改變相應(yīng)蛋白的功能，與DKK3啟動子甲基化共同作用，促進粒層細胞瘤的發(fā)生;有關(guān)DKK3七號外顯子在其他腫瘤中是否存在A--＞G突變

15、及其意義，文獻中尚未見相關(guān)報道。(7)本課題研究發(fā)現(xiàn)10例卵巢粒層細胞瘤中FOXL2-C134W位點均存在C--＞G突變，與文獻報道一致，是成人型卵巢粒層細胞瘤的一個特征性分子事件。(8)本課題發(fā)現(xiàn)在10例卵巢粒層細胞瘤有7例同時發(fā)生FOXL2啟動子高甲基化與FOXL2-C134W的C--＞G突變，3例同時發(fā)生DKK3啟動子的高甲基化與DKK3七號外顯子A--＞G突變，提示在卵巢粒層細胞瘤中，特定抑癌基因的甲基化可能通過某種機制造成特點

16、位點基因序列的改變;亦有可能作為表觀調(diào)控的異常，抑癌基因啟動子甲基化本身并不改變基因序列，但可能與基因突變同時存在。若二者為同時存在，逆轉(zhuǎn)啟動子的甲基化則無法同時逆轉(zhuǎn)基因序列的改變，并不能重新激活基因的表達活性，單純?nèi)ゼ谆委焺t可能無效，從而為以去甲基化為靶點的藥物的研發(fā)作出了有益的提示。因本研究樣本較小，無法對DKK3啟動子的高甲基化與DKK3七號外顯子A--＞G突變、FOXL2啟動子甲基化與FOXL2-C134W位點突變的相關(guān)性作