1、腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，生存率低，研究表明，miRNA表達異常、DNA甲基化狀態(tài)改變、組蛋白修飾等表觀遺傳機制的異常在腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本實驗室前期采用最新高通量甲基化DNA免疫沉淀（MeDIP）結合啟動子區(qū)及CpG島芯片技術，篩選并初步建立腦膠質瘤基因組DNA甲基化譜。通過Massarray、亞硫酸氫鹽修飾直接測序法(BSP)等進行檢測，發(fā)現并驗證了LRRC4等9個腦膠質瘤中新的高甲基化基因。通過H

2、PLC-DAD技術對全基因組甲基化分析發(fā)現，抑瘤性miR-185可通過直接靶向DNMT1的表達而影響全基因組的甲基化水平，進而調控上述高甲基化基因在腦膠質瘤中的甲基化修飾狀態(tài)，恢復這些基因在腦膠質瘤中的表達。
　　【確定F10、POTEH、CPEB1、LM03、ELFN2及PRDM16為腦膠質瘤中新的低甲基化基因，其甲基化狀態(tài)和表達與腦膠質瘤患者的預后密切相關】
　　在上述研究工作基礎上，本課題利用Signalmap軟件對甲

3、基化芯片篩選出的74個低甲基化基因進行再次篩選，挑選出F10、POTEH、CPEB1、LM03、ELFN2、PRDM16、CD207、BAD、NRBP2、SLITRK5、SLC44A2及PGP等12個基因進行驗證。通過BSP方法在大樣本腦膠質瘤組織中檢測，發(fā)現CD207、BAD、NRBP2、SLITRK5、SLC44A2及PGP基因在腦膠質瘤組織（n=6例）中的甲基化程度與正常腦組織（n=4例）無差異;證實F10（n=102例）、POT

4、EH（n=102例）、CPEB1（n=56例）、LMO3（n=56例）、ELFN2（n=56例）及PRDM16( n=56例）基因在腦膠質瘤組織和細胞中發(fā)生低甲基化，是腦膠質瘤中新發(fā)現的低甲基化基因，這些基因的低甲基化與其在腦膠質瘤中的高表達密切相關。通過對腦膠質瘤患者的跟蹤隨訪發(fā)現，這些新發(fā)現的低甲基化基因的低甲基化及其在腦膠質瘤中的高表達均可以作為腦膠質瘤患者預后預測的重要標志，低甲基化基因在腦膠質瘤中的甲基化程度越低、表達越高，患

5、者的預后越差。同時。F10基因低甲基化與患者年齡相關;POTEH蛋白高表達及PRDM16基因低甲基化與患者病理分級相關。因此，POTEH基因的高表達和PRDM16基因的低甲基化是腦膠質瘤惡性進展的重要分子診斷標志物，POTEH基因在腦膠質瘤中表達越高或PRDM16基因在腦膠質瘤中的甲基化程度越低，其腦膠質瘤的惡性程度就越高。
　　【miR-101在腦膠質瘤中表達下調或缺失，是腦膠質瘤患者早期發(fā)病的重要分子標志物，并與腦膠質瘤患者的

6、預后密切相關，其表達越低，患者預后越差】
　　有文獻證實，miR-101在多種腫瘤中表達降低并發(fā)揮抑瘤基因的作用。因此，我們用原位雜交的方法進一步檢測了腦膠質瘤組織( n=50例)和正常腦組織（n=10例）中的表達，結果證實，miR-101在腦膠質瘤組織中的表達低于正常腦組織，腦膠質瘤I級患者中顯著高于其它級別的腦膠質瘤患者，但在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級腦膠質瘤組織中的表達無差異，所以我們認為miR-101的表達下調與腦膠質瘤患者的早期發(fā)病密

7、切相關，與腦膠質瘤的惡性進展無關。miR-101在腦膠質瘤組織中的表達與患者的年齡、性別無關。通過對腦膠質瘤患者的跟蹤隨訪發(fā)現，miR-101在腦膠質瘤中的低表達可以作為腦膠質瘤患者早期發(fā)病和預后預測的重要標志，miR-101在腦膠質瘤中表達越低，患者的預后越差。
　　【低甲基化基因CPEB1、PRDM16和ELFN2是miR-101的直接作用靶基因，miR-10I靶向抑制它們在腦膠質瘤細胞中的表達】
　　許多研究已經證實m

8、iRNA在腫瘤中通過調控基因的表達發(fā)揮著非常重要的作用。我們設想從miRNA調控靶基因表達的角度來分析低甲基化基因表達上調的機制。于是預測了能調控F10、POTEH、CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16的miRNA，試圖從中找出共同點或某種規(guī)律。令我們興奮的是，在線軟件Targetscan6.0預測發(fā)現CPEB1、ELFN2、LMO3及PRDM16可以共同受一個miRNA-miR-101的調控。熒光素酶活性檢測、real-ti

9、me PCR和Westem-blot檢測表明，miR-101能與CPEB1、PRDM16和ELFN23'UTR結合，并且靶向抑制它們在腦膠質瘤細胞中的表達;miR-101雖不與LM033'-UTR結合，但是仍然可以抑制LM03在腦膠質瘤細胞中的表達。
　　【miR-101靶向抑制EZH2、EED和DNMT3A的表達，下調甲基轉移酶活性，抑制LMO3核心啟動子區(qū)H3K4me2、H3K27me3水平，增加H3K9me3和H4K20me

10、3水平，增加LMO3啟動子區(qū)甲基化水平，間接抑制LM03在腦膠質瘤細胞中的表達】
　　我們進一步研究miR-101調控低甲基化基因LMO3表達的機制。有文獻證實，組蛋白甲基轉移酶EZH2是miR-101的直接靶基因，我們通過在線軟件Targetscan6.0、miRanda及PicTar預測發(fā)現組蛋白甲基轉移酶EED及DNA甲基轉移酶DNMT3A是miR-101的靶基因，并且證實miR-101在腦膠質瘤細胞中直接抑制EZH2、EE

11、D及DNMT3A的表達，miR-101還能抑制膠質瘤細胞中H3K4去甲基化酶、H3K27甲基轉移酶、DNMT3A甲基轉移酶活性，增加H3K9甲基轉移酶和DNMT甲基轉移酶活性。鑒于EZH2、EED及DNMT3A具有甲基轉移酶活性，我們認為，miR-101極可能通過EZH2、EED及DNMT3A影響組蛋白甲基化修飾。于是，我們檢測了miR-101及干擾EZH2、EED及DNMT3A的表達對LM03核心啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾的影響，發(fā)現m

12、iR-IOI通過靶向抑制EZH2、EED及DNMT3A的表達抑制LM03核心啟動子區(qū)H3K27me3和H3K4me2水平，增加H3K9me3和H4K20me3水平，增加LMO3啟動子區(qū)甲基化水平，間接抑制LMO3在腦膠質瘤細胞中的表達。
　　【miR-101通過靶向EZH2、EED和DNMT3A調控低甲基化基因CPEB1、ELFN2和PRDM16核心啟動子區(qū)的組蛋白甲基化修飾，影響其甲基化水平，間接抑制它們在腦膠質瘤細胞中的表達】

13、
　　既然miR-101能通過組蛋白修飾調控LMO3的甲基化狀態(tài)及表達，也可能以同樣的機制調控低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16的甲基化狀態(tài)。因此，我們檢測了miR-101和干擾EZH2、EED及DNMT3A的表達對低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16表達以及對其核心啟動子區(qū)組蛋白甲基化修飾的影響，并檢測了miR-101對低甲基化基因CPEB1、ELFN2及PRDM16甲基化狀態(tài)的影響。通過ChIP結合q

14、RT-PCR、BSP等實驗證實miR-101通過靶向EZH2、EED和DNMT3A，降低CPEBI、PRDM16及ELFN2核心啟動子區(qū)H3K4me2、H3K27me3的水平，增加CPEB1、PRDM16核心啟動子區(qū)H3K9me3、H4K20me3水平，恢復CPEB1、ELFN2及PRDM16基因啟動子區(qū)甲基化水平，間接抑制低甲基化基因在腦膠質瘤細胞中的表達。
　　【miR-101通過下調高甲基化基因LRRC4核心啟動子區(qū)H3K2

15、7me3水平，使LRRC4啟動子區(qū)去甲基化，恢復LRRC4在腦膠質瘤細胞中的表達】
　　LRRC4是我室自主克隆的腦膠質瘤抑瘤基因，并被證實在腦膠質瘤中高甲基化。為了研究LRRC4在腦膠質瘤中的調控機制，我們首先預測了調控LRRC4的miRNA，發(fā)現LRRC4是miR-101的預測靶基因，驗證發(fā)現miR-101并不與LRRC43'UTR結合，但是miR-101能上調膠質瘤細胞中LRRC4的表達并低甲基化LRRC4，抑制EZH2、E

16、ED及DNMT3A的表達能抑制LRRC4核心啟動子區(qū)H3K27me3水平促進表達上調，說明miR-101通過抑制EZH2、EED及DNMT3A的表達，抑制LRRC4核心啟動子區(qū)H3K27me3水平，使LRRC4啟動子區(qū)去甲基化，從而恢復LRRC4在腦膠質瘤細胞中的表達。
　　總之，基因的高、低甲基化異常修飾在腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，通過檢測基因在腦膠質瘤中的高、低甲基化及其表達，可以用于腦膠質瘤的早期診斷和預后預測。m