1、實(shí)驗(yàn)背景：
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)型惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康，發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化所致的基因沉默在腫瘤發(fā)生中是一種最基礎(chǔ)的表觀遺傳學(xué)事件，也是腫瘤中最普遍的腫瘤抑制子失活機(jī)制之一。去甲基化藥物可逆轉(zhuǎn)基因的甲基化修飾，抑制腫瘤生長。Wnt通路在腫瘤細(xì)胞中常異?；罨?，是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要事件。該通路的異常激活既可能是由Wnts及其受體復(fù)合物、通路中一種或幾種成份過表達(dá)或突變所

2、致，也可能是由Wnt通路胞外抑制子基因失活或表達(dá)降低而導(dǎo)致。
　　 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 本研究從基因水平分別分析膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Wnt信號通路胞外抑制子基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況，研究Wnt通路抑制子在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，同時(shí)研究去甲基化藥物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，為去甲基化藥物應(yīng)用于膠質(zhì)瘤的治療提供研究依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 甲基化特異性PCR(Methylation-specific PC

3、R,MSP)分析膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251中Wnt通路抑制子SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1及WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化；使用去甲基化藥物5-Aza-2'-deoxycytidine(ADC)和去乙?；敢种苿㏕richostatinA(TSA)共同作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，半定量RT-PCR分析藥物處理前后SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1及WIF-1基因以及Wnt/β-catenin下游靶基

4、因CCND1的mRNA表達(dá)水平;MTT法測定藥物作用前后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成能力。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.MSP對Wnt信號通路抑制子SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1、WIF-1啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化分析結(jié)果顯示：與對照組相比，53例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中，上述5個(gè)抑制基因在45例組織樣本中至少有1個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化(83％)，WHOⅡ級膠質(zhì)瘤中占18/19(94.74％)，WH

5、OⅢ級膠質(zhì)瘤中占15/22(68.18％)，WHOⅣ級膠質(zhì)瘤中占10/12(83.33％)；SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1與WIF-1在腫瘤組織中發(fā)生甲基化的比例分別為43.40％，28.30％，26.42％，66.04％，13.21％。其中，SFRP1在WHOⅡ、Ⅲ級中的比例分別高于WHOⅣ級(Ⅱ：P＜0.01，Ⅲ：P＜0.05);SFRP5在WHOⅡ中的甲基化比例明顯高于在WHOⅢ、Ⅳ級中的比例(Ⅲ+Ⅳ：P＜0.05)

6、，SFRP2、DKK1、WIF-1在各個(gè)級別均有明顯甲基化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？傮w來講，在組織樣本中，這5個(gè)抑制基因甲基化程度隨著腫瘤級別的升高而逐漸降低，其中高級別腫瘤(WHOⅢ、Ⅳ級)中的甲基化比例明顯低于WHOⅡ級(P＜0.05)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251中，Wnt通路抑制子SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1和WIF-1啟動(dòng)子區(qū)均高甲基化。
　　 2.RT-PCR半定量分析顯示：在對照組中，兩種細(xì)胞系中SFR

7、P1低水平表達(dá)，DKK1表達(dá)水平較高，其余三個(gè)抑制子基因幾乎不表達(dá)；使用甲基化藥物處理后，A172細(xì)胞中SFRP1和SFRP2表達(dá)水平增高(P＜0.05)；SFRP5和WIF-1表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；DKK1與對照相比表達(dá)水平略有降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。U251細(xì)胞中SFRP1、SFRP2和WIF-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，SFRP5的表達(dá)與對照組相比明顯升高(P＜0.05)；DKK1的表達(dá)也有

8、所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.去甲基化藥物可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172中Wnt/β-catenin的靶基因CCND1表達(dá)水平下調(diào)(P＜0.05)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中有類似結(jié)果，CCND1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。
　　 4.MTT法測定表明，去甲基化處理可以明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、A172的增殖能力。軟瓊脂細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲基化處理可以明顯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、

9、A172的集落形成能力。
　　 結(jié)論：
　　 1.膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251中，Wnt通路抑制基因SFRP1、SFRP2、SFRP5、DKK1和WIF-1的啟動(dòng)子區(qū)存在明顯的高甲基化修飾。
　　 2.去甲基化藥物可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251中Wnt信號通路抑制基因SFRP1、SFRP2、SFRP5和WIF-1的表達(dá)增加，使Wnt/β-catenin靶基因CCND1表達(dá)下調(diào)；表明在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中