1、背景與目的：活化的HSC凋亡障礙是肝纖維化難以逆轉(zhuǎn)的主要原因。異喹啉生物堿具有明顯細(xì)胞毒作用，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。為了保留異喹啉生物堿促凋亡活性并降低其細(xì)胞毒性，與復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系合作，我們構(gòu)建了新型異喹啉類小分子化合物庫(kù)。本課題的目的是從新型異喹啉類小分子庫(kù)篩選出細(xì)胞毒性低促凋亡生物活性強(qiáng)的具有抗肝纖維化作用的新型異喹啉小分子化合物，由此希望研發(fā)出一類新型抗肝纖維化藥物先導(dǎo)化合物。
　　方法：小分子化合物的篩查：（1）將復(fù)旦大

2、學(xué)化學(xué)系合成的小分子化合物分類整理。（2）MTT法檢測(cè)不同小分子化合物不同濃度（0μg/ml,2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml）處理HSC-T6細(xì)胞24小時(shí)后，HSC增殖改變，并計(jì)算IC50值。（3）Hochest法檢測(cè)上述篩選出的陽(yáng)性化合物（IC50<100μg/ml）對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　12-4-Y促HSC凋亡機(jī)制的探索：（1）MTT法檢測(cè)不同濃

3、度12-4-Y處理HSC-T6不同時(shí)間(12h、24h、36h、48h)后HSC增殖變化，臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活力；（2）Hoechst染色檢測(cè)凋亡小體；（3）流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性檢測(cè)；（4）檢測(cè)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3及其活化形式的表達(dá)變化；（5）Real time PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化。
　　結(jié)果：（1）MTT結(jié)果提示，所構(gòu)建的類天然小分子化合物庫(kù)中存在6種化合物（12-4-Y、12-1-Y、09-4-Y、

4、15-1-Y、11-2-Y、09-3-Y）對(duì) HSC-T6細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，并且呈濃度依賴性，這6種陽(yáng)性化合物的IC50值都在100μg/ml以內(nèi)。（2）Hochest染色結(jié)果顯示，上述陽(yáng)性化合物中有1種化合物處理HSC-T6后可見(jiàn)明顯的凋亡小體。這種化合物的編號(hào)為12-4-Y（1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并[5,1-a]異喹啉）。（3）進(jìn)一步以不同濃度的12-4-Y處理HSC-T6細(xì)胞株后，MTT顯示12-4-Y在12-4

5、8h及5-80μg/ml范圍內(nèi)可呈時(shí)間及濃度依賴性抑制HSC-T6增殖，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示40μg/ml12-4-Y處理HSC-T6細(xì)胞系12h后細(xì)胞藍(lán)染（0.53±0.04）％，與對(duì)照組（0.98±0.02）%相比明顯增多（P<0.05）；（4）20μg/ml12-4-Y處理HSC-T6細(xì)胞系24h后，Hoechst染色結(jié)果提示HSC-T6細(xì)胞系內(nèi)可見(jiàn)較多的凋亡小體，同時(shí)流式細(xì)胞儀凋亡定量檢測(cè)分析提示凋亡率為（29.23±1.20）%，顯

6、著高于對(duì)照組（5.47±1.39）%（P<0.001）；（5）Western blot結(jié)果提示凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase3的裂解產(chǎn)物表達(dá)較空白對(duì)照組顯著增加。（6）Real time PCR結(jié)果提示10μg/ml、20μg/ml12-4-Y與HSC-T6共孵育24h后，線粒體凋亡途徑相關(guān)的促凋亡基因 Bax、Caspase9的表達(dá)顯著上調(diào),抑制凋亡相關(guān)基因 Bc l2表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：從異喹啉類小分子化合物