1、M a y , 2 0 1 1上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文擬南芥轉(zhuǎn)錄因子D Y T l 的功能分析摘 要D 坯F 洲C 刀刎悄三T A P E T U M l ( D Y T l ) 是一個在擬南芥花藥發(fā)育以及絨氈層早期分化與行使功能過程中必不可少的中心調(diào)控因子。本研究分析了D Y T l 啟動子的順式元件，并對其核心區(qū)域啟動子的時空表達做了進一步研究，我們將可互補的啟動子片段的5 ’端逐級缺失成六段( 按轉(zhuǎn)錄起始方向，．6 3 1 、．5

2、 5 0 、- 4 6 3 、．3 3 1 、．1 8 0 、．9 4 ) ，分別構(gòu)建入含報告基因G U S 的p B l l 2 1 載體中，并取代p P B I l 2 1中的C a M V 3 5 S 啟動子，轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株，獲取轉(zhuǎn)基因株系。組織化學(xué)染色分析六株轉(zhuǎn)基因植株花序花藥，．6 3 1 、．5 5 0 啟動子片段花藥染色呈陽性，而- 4 6 3 啟動子片段以及進一步缺失的片段因缺失了具A C G T 和G T G A

3、 等順式元件的核心啟動子區(qū)域，故而無法檢測到G U S 的活性。?。? 5 0 啟動子片段的花藥為材料，制備G U S 探針，原位雜交實驗表明該長度啟動子片段驅(qū)動G U S 在花藥發(fā)育的第三期開始在絨氈層表達，到第五期的表達量達到最高，并在隨后的時期內(nèi)表達量逐漸降低，與先前報道的D Y T l 在野生型L e r 中的表達譜相一致，表明該段啟動子包含了D Y T l 正常表達的遺傳信息，并存在潛在的上游調(diào)控基因的結(jié)合位點。·

4、·為進一步探究轉(zhuǎn)錄因子D Y T l 結(jié)合的下游靶基因，本研究小組根據(jù)N C B I數(shù)據(jù)庫的序列設(shè)計D Y T l 特異性引物，經(jīng)P C R 擴增其6 2 4 b pc D N A 片段后，將擴增出的片段連入p M D l 8 ．T 載體中，E c o R l 和勛D ，雙酶切后克隆到具相同酶切位點的原核表達載體p E T ．3 2 “+ ) 中，以構(gòu)建D F T l 原核表達載體，I P T G 誘導(dǎo)表達重組蛋白并將可溶性重

5、組蛋白作為抗原免疫新西蘭兔以制備多克隆抗血清。W e s t e m B l o t 法檢測多克隆抗體的特異性，E L I S A 測定多克隆抗血清的效價。結(jié)果表明：構(gòu)建的原核表達載體轉(zhuǎn)化入表達菌株B L 2 1 菌株后，經(jīng)I P T G 誘導(dǎo)，成功地表達了分子量約為5 0 K D a 的重組蛋白。W e s t e r nB l o t 證實其具良好的免疫原性，E L I S A 結(jié)果表明融合蛋白的效價> 1 ：5 1 2 0