1、花生是重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。我國是世界上種植花生的主要國家之一?；ㄉa(chǎn)區(qū)主要分布于干旱和半干旱地區(qū)，干旱嚴(yán)重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)，是花生生產(chǎn)的首要限制因子。我國有70％的花生面積受到不同程度的干旱危害，平均減產(chǎn)20％以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，解決干旱對花生生產(chǎn)的影響是當(dāng)務(wù)之急。 植物在其生長過程中經(jīng)常會遭受到不同程度的生物和非生物逆境脅迫，這些脅迫嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的負(fù)面影響。研究發(fā)現(xiàn)，在長期

2、的生物進(jìn)化過程中，植物自身已經(jīng)發(fā)展了多種抵抗干旱脅迫的機(jī)制，以通過調(diào)節(jié)自身生理和代謝變化來抵御干旱。其中的一個重要機(jī)制就是通過逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來啟動逆境脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。在脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，轉(zhuǎn)錄因子由于能夠調(diào)節(jié)多個脅迫響應(yīng)功能基因的表達(dá)而備受關(guān)注。 NAC轉(zhuǎn)錄因子是近十年來發(fā)現(xiàn)的植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和防御抵抗多種生物和非生物脅迫、及作物產(chǎn)量和品質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子的N端高度保守，

3、含有NAM保守結(jié)構(gòu)域，為DNA結(jié)合區(qū)，C端則高度變異，為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。 我們從出口型大花生魯花14不同發(fā)育時期種子混合cDNA文庫中克隆鑒定出了2個花生NAC類基因，分別命名為AhNAC1( GenBank登錄號為EU669863)和AhNAC2。利用RT—PCR技術(shù)，從花生cDNA中擴(kuò)增得到這兩個基因的cDNA全長。序列分析表明，AhNAC1基因的cDNA序列長度為1453 bp，其開放閱讀框(ORF)長度為912 bp，編碼3

4、03個氨基酸，預(yù)測其分子量為34.1 kD，等電點(diǎn)為7.6。而AhNAC2基因的cDNA為1573 bp，ORF為1050 bp，編碼349個氨基酸，預(yù)測其分子量為39.1 kD，等電點(diǎn)為7.66。通過與其他NAC蛋白序列比對，AhNAC1和AhNAC2均聚類到ATAF亞家族中，預(yù)測AhNAC1可能在花生種子發(fā)育中起作用，而AhNAC2可能參與了干旱等非生物脅迫反應(yīng)。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用半定量RT—PCR的方法分析了AhNAC

5、2在干旱、鹽漬、低溫和ABA處理下的表達(dá)變化。結(jié)果表明：該基因的表達(dá)受到干旱誘導(dǎo)最為明顯，且其表達(dá)隨處理的時間出現(xiàn)峰值變化，而ABA處理后表達(dá)變化無明顯差異。 酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)、區(qū)域缺失試驗(yàn)和顯色反應(yīng)證明了AhNAC2的激活域位于C端，而基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的瞬時表達(dá)表明了AhNAC2—GFP融合蛋白特異定位在細(xì)胞核中。這些結(jié)果表明AhNAC2具有轉(zhuǎn)錄因子的特征。 此外，為了功能驗(yàn)證，我們構(gòu)建了AhNAC2基因的過量表

6、達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法成功轉(zhuǎn)到煙草中，篩選到轉(zhuǎn)基因株系，并對后代進(jìn)行干旱耐受性分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草抗旱能力較野生型顯著提高。而不同濃度ABA處理后，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型無明顯差異。在正常生長狀態(tài)下，過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系可以誘導(dǎo)含有DRE/CRT元件的某些下游基因大量表達(dá)，而對照中表達(dá)量較低，因此推測AhNAC2基因可能具有誘導(dǎo)非生物脅迫相關(guān)的COR/RD基因表達(dá)的能力。此外，離體葉片的失水實(shí)驗(yàn)也證明了轉(zhuǎn)基因株系的耐早能力