1、本研究分為二部分：
　　第一部分：氧化型ATM對乳腺癌CAFs細胞增殖的調(diào)控作用及其機制研究
　　目的：探討氧化型ATM對乳腺癌CAFs增殖的調(diào)控作用及其機制。
　　方法：
　?、乓哉n題組前期構(gòu)建的永生化乳腺癌NFs和CAFs為模型，采用MTT法、生長密度實驗、流式細胞分析和蛋白印跡實驗檢測乳腺癌CAFs的異常增殖行為。
　　⑵蛋白印跡、細胞免疫熒光和免疫組化實驗檢測乳腺癌NFs和CAFs中p-ATM（s1

2、981）、ATM和γH2AX（s139）的蛋白表達量。各種ROS抑制劑處理乳腺癌CAFs，DCFH熒光探針實驗檢測乳腺癌CAFs中ROS含量改變，蛋白印跡實驗檢測CAFs細胞ATM氧化活化的改變。
　?、菓肁TM特異抑制劑KU60019和siRNA技術(shù)抑制乳腺癌CAFs中氧化型ATM功能，觀察氧化型ATM功能缺失對乳腺癌CAFs增殖的作用。
　?、扔肒U60019和NAC同時處理乳腺癌CAFs，分析NAC對ATM功能缺失所

3、致CAFs增殖缺陷的影響。
　　⑸使用KU60019處理CAFs，蛋白印跡實驗檢測KU60019對MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號通路活性的影響。采用U0126、LY294002和XAV939抑制劑處理CAFs，檢測MEK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號通路失活對CAFs增殖的作用。
　?、视肒U60019、U0126、LY294002和 XAV939處理CAFs，蛋白印跡檢測ATM功能、MEK-MAP

4、K、PI3K-AKT和WNT信號通路失活對CAFs中GSK3β、β-catenin和c-Myc蛋白表達的影響。同樣條件下，ChIP實驗檢測處理前后CAFs細胞β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的改變。運用siRNA技術(shù)敲除CAFs中c-Myc，觀察c-Myc敲除對CAFs增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　⑴MTT實驗、細胞密度實驗、流式細胞分析和蛋白印跡實驗的結(jié)果顯示，與NFs相比，CAFs增殖速度快、生長密度大、S期細胞比例高以及細胞

5、增殖正向調(diào)控蛋白表達升高，這說明乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。
　?、婆cNFs相比，CAFs中p-ATM（s1981）、ATM和p-AKT（s473）蛋白表達升高，γH2AX（s139）蛋白表達無變化。在各種ROS抑制劑處理下，只有NAC、DPI和rotenone能降低CAFs細胞中的ROS水平和p-ATM（s1981）蛋白表達量。
　?、桥c對照相比，KU60019抑制或ATM基因敲除明顯抑制CAFs增殖速率、降低CAFs

6、生長密度、減少CAFs S期細胞比例、抑制細胞增殖正向調(diào)控蛋白表達，這說明氧化型ATM具有促CAFs增殖作用。
　?、扰c溶劑對照相比，NAC能逆轉(zhuǎn)KU60019處理所致CAFs細胞OS，但僅能小部分逆轉(zhuǎn)KU60019所導致的CAFs增殖缺陷。
　　⑸蛋白印跡實驗結(jié)果顯示，KU60019顯著抑制CAFs中ERK-MAPK、PI3K-AKT和WNT信號通路活性。與溶劑對照相比，U0126、LY294002和XAV939單獨或聯(lián)合

7、處理抑制CAFs增殖。
　　⑹蛋白印跡實驗結(jié)果表明，KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能增強GSK3β激酶活性，抑制β-catenin和c-Myc蛋白表達。ChIP實驗結(jié)果顯示，KU60019、U0126、LY294002和XAV939均能阻斷β-catenin轉(zhuǎn)錄活性。與對照相比，c-Myc敲除能抑制CAFs增殖。
　　結(jié)論：
　?、排c乳腺癌NFs細胞相比，乳腺癌CAFs具有異常增殖表型。<

8、br>　　⑵乳腺癌CAFs中存在非DSBs依賴性ATM氧化活化現(xiàn)象。
　?、茄趸虯TM促乳腺癌CAFs增殖。
　?、妊趸虯TM氧化還原維持功能對乳腺癌CAFs增殖調(diào)控作用有限。
　?、裳趸虯TM主要通過增強ERK-MAPK，PI3K-AKT和WNT信號通路活性促進乳腺癌CAFs細胞增殖。
　?、师?Catenin/c-Myc軸介導氧化型ATM促CAFs增殖功能。
　　第二部分：氧化型ATM對低氧乳腺癌

9、CAFs細胞EMR的調(diào)控作用及其機制研究
　　目的：研究氧化型ATM對低氧乳腺癌CAFs細胞EMR的調(diào)控作用及其機制。
　　方法：
　?、欧治鋈橄侔〤AFs/NFs mRNA表達芯片，挖掘乳腺癌CAFs細胞中異常表達的能量代謝相關(guān)基因，qRT-PCR法驗證。與常氧NFs相比，葡萄糖消耗速率、乳酸產(chǎn)生速率、蛋白印跡、線粒體活性和電鏡等實驗檢測低氧對CAFs EMR的影響。
　?、婆c溶劑對照相比，探討抗氧化劑NAC和

10、線粒體呼吸鏈復合酶體Ⅲ抑制劑rotenone對低氧CAFs EMR的影響。
　?、且匀軇閷φ眨鞍子≯E實驗檢測NAC和rotenone對低氧CAFs ATM氧化活化的作用。用KU60019處理CAFs，探討氧化型ATM功能缺失對低氧CAFs EMR的影響。
　?、炔捎昧姿峄鞍踪|(zhì)組學技術(shù)和生物信息學技術(shù)篩選低氧CAFs氧化型ATM下游潛在的能量代謝相關(guān)底物。
　　結(jié)果：
　　⑴mRNA芯片和qRT-PCR實驗結(jié)

11、果顯示，在乳腺癌CAFs中，許多糖酵解基因表達上調(diào)，很多OP基因表達下調(diào)，能量代謝相關(guān)信號通路異?；罨?。與常氧NFs相比，低氧CAFs的葡萄糖消耗速率和乳酸產(chǎn)生速率明顯升高，促能量代謝蛋白表達上調(diào)，線粒體活性被嚴重抑制，線粒體嵴和數(shù)量顯著減少。這表明低氧誘導CAFs細胞具有典型的EMR表型。
　?、芌OS水平檢測、蛋白印跡和代謝實驗結(jié)果表明，NAC和rotenone抑制低氧CAFs細胞ROS升高和EMR。
　?、堑鞍子≯E實驗

12、的結(jié)果顯示，NAC和rotenone抑制低氧CAFs ATM的氧化活化。蛋白印跡和代謝實驗的結(jié)果表明，氧化型ATM功能喪失抑制低氧乳腺癌CAFs EMR。這表明，氧化型ATM具有促進低氧CAFs EMR功能。
　?、攘姿峄鞍踪|(zhì)組學實驗和生物信息學分析結(jié)果顯示，低氧CAFs細胞氧化型ATM下游具有許多新的潛在的能量代謝相關(guān)底物。
　　結(jié)論：
　　⑴低氧誘導乳腺癌CAFs產(chǎn)生典型的EMR表型。
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