1、心肌肥厚是由細(xì)胞外刺激信號(hào)作用于細(xì)胞并通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的活化與失活，并最終引起細(xì)胞表型改變的過程。它主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的肥大和間質(zhì)成分的改變。早期的病理性心肌肥厚為代償性反應(yīng)，可以平衡室壁壓力，維持心輸出量，消除初始刺激的影響。但長(zhǎng)期心肌肥厚會(huì)導(dǎo)致心功能失代償，心肌細(xì)胞凋亡，直至心肌擴(kuò)張，最終發(fā)生心力衰竭。從細(xì)胞和分子水平上看，心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制主要包括以下3個(gè)環(huán)節(jié):細(xì)胞外的刺激信號(hào)，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞核

2、內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄的活化。
　　脂肪組織是機(jī)體最大的內(nèi)分泌和旁分泌器官，能夠分泌多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)。不僅調(diào)控體內(nèi)能量平衡，而且在調(diào)節(jié)胰島素敏感性、糖尿病、凝血、纖溶、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化等的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮的重要作用。其中發(fā)揮促炎作用的有腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-6)、纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、瘦素(leptin)、抵抗素(resistin)、趨化素(chemerin)、內(nèi)脂素(vis fatin)

3、、視黃醇結(jié)合蛋白(retinol bindingprorein，RBP)等，而網(wǎng)膜素(resistin)、脂連素(adiponectin)、Clq/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9（CTRP9）等主要發(fā)揮抗炎作用。
　　分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(sFRP5)是一種新近發(fā)現(xiàn)的與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)的脂肪細(xì)胞因子和抗炎因子，屬于分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secretedFrizzled-related protein，sFRP)家族中的一員，主要由白色脂

4、肪組織分泌，它除了可以在脂肪組織中表達(dá)外，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在胰腺中也有表達(dá)，在肝臟和肌肉組織中也有微弱表達(dá)。已經(jīng)有研究證實(shí)，分泌型卷曲相關(guān)蛋白1-4在心肌組織中表達(dá)，分泌型卷曲相關(guān)蛋白3、4在心肌肥厚中表達(dá)增加。在結(jié)構(gòu)上，分泌型卷曲相關(guān)蛋白通過具有同源結(jié)構(gòu)的半胱氨酸富含區(qū)(Cysyerne rich region，CRD)與Wnt信號(hào)通路的特異性受體卷曲蛋白受體(frizzled receptor，F(xiàn)z)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，從而抑制

5、Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)。Wnt蛋白是一組富含半胱氨酸的糖基化蛋白，參與細(xì)胞的增殖、分化、控制細(xì)胞的定位以及凋亡等過程。目前已經(jīng)證實(shí)Wnt通路與心肌肥厚有一定關(guān)聯(lián)，抑制Wnt通路在逆轉(zhuǎn)心肌肥厚過程中發(fā)揮有效作用。Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及機(jī)體免疫等多種病理生理過程。研究表明，Wnt信號(hào)通路在心臟發(fā)育和血管生成中起重要作用，心臟發(fā)育早期激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)心臟祖細(xì)胞增殖和遷移，在心臟發(fā)育晚期抑制其活性

6、可以促進(jìn)心肌細(xì)胞分化，近年在心血管疾病的發(fā)生以及發(fā)展中的作用被廣泛關(guān)注。研究證實(shí)，分泌型卷曲相關(guān)蛋白5作為抗炎癥因子可能在動(dòng)脈粥樣硬化中具有保護(hù)作用。
　　血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)能促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，心肌成纖維細(xì)胞增殖，在心肌肥厚過程中起著重要作用。AngⅡ的生物學(xué)作用主要是通過AngⅡ1型受體(AngⅡtypes1 receptor，AT1R)和AngⅡ2型受體(AngⅡtypes2 receptor，

7、AT2R)介導(dǎo)的。這兩種受體均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，但是它們的組織分布以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是不相同的。AngⅡ與AT1R結(jié)合可引起心肌肥厚和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的積聚、促進(jìn)醛固酮分泌等，而AngⅡ與AT2R結(jié)合則起與AT1R結(jié)合相反的作用，可使血管擴(kuò)張、抗平滑肌細(xì)胞增殖和參與組織修復(fù)等起到保護(hù)作用。已有研究證實(shí)在心室肥厚、心肌梗死以及心力衰竭時(shí)AT2R表達(dá)相對(duì)上調(diào)，介導(dǎo)AngⅡ的主要作用。AT1R主要分布于肺、血管平滑肌、肝、腎、腎上腺等器官

8、，而AT2R則主要分布于胚胎組織、腦和生殖器官等。由此我們猜測(cè)sFRP5在心肌肥厚中的表達(dá)是否與這兩種受體有關(guān)，究竟是由哪種受體介導(dǎo)的，是本研究的主要內(nèi)容之一。
　　Rho/ROCK(Rho-associated coiled-coil protein kinase)信號(hào)通路位于多種信號(hào)通路的上游，有“分子開關(guān)”的作用，它將胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，從而調(diào)控相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)。是多種組織細(xì)胞中普遍存在的一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。大量研究表明Rh

9、o/ROCK信號(hào)通路廣泛參與心血管系統(tǒng)的各種病理生理進(jìn)程，例如心肌細(xì)胞收縮、遷移、增殖、凋亡，心肌肥厚，心肌梗死后心室重塑等。Rho激酶可能參與調(diào)控AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥厚和血管平滑肌肥大等過程，Rho/ROCK通路參與了AT1 R的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protine kinase，MAPK)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑之一，是細(xì)胞膜信號(hào)向核信號(hào)傳遞的樞紐。該通路是絲氨酸/蘇

10、氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)有四種亞型:細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1、2(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)，P38MAPK，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK)和ERK5，它們?cè)谡{(diào)控細(xì)胞功能時(shí)相互交錯(cuò)，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等一系列不同的生理過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)在已有研究證實(shí)MAPK的激活是心肌細(xì)胞肥大和由收縮型向肥厚型轉(zhuǎn)換的最后通路，與

11、心肌重構(gòu)及心衰的發(fā)生密切相關(guān)。JNK信號(hào)通路是MAPKs家族的重要通路之一，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，是多種胞漿信號(hào)向核內(nèi)傳遞的樞鈕。已有研究證實(shí)，激活的Rho/ROCK信號(hào)通路可以通過JNK通路介導(dǎo)的心肌纖維化過程。
　　綜上所述，我們推測(cè)sFRP5可以在心肌細(xì)胞中表達(dá)，并且在心肌肥大過程中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。本研究以培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞為研究靶細(xì)胞，采用Western Blot和Real-timePCR技術(shù)觀察AngⅡ誘

12、導(dǎo)心肌細(xì)胞sFRP5表達(dá)的變化情況;并探討AngⅡ-AT1R/Rho/ROCK/JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞sFRP5表達(dá)過程中的可能作用。本研究主要包括以下三部分:
　　第一部分分泌型卷曲相關(guān)蛋白5在心肌細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:成功提取并培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，觀察心肌細(xì)胞是否表達(dá)分泌型卷曲相關(guān)蛋白5，為以后的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:購買出生2-3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h

13、后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后應(yīng)用RT-PCR、Western-Blot、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察心肌細(xì)胞中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表達(dá)情況。
　　結(jié)果:Real-Time PCR結(jié)果示:SD乳鼠心肌細(xì)胞中有分泌型卷曲相關(guān)蛋白5在mRNA的表達(dá)。Western-Blot結(jié)果示:SD乳鼠心肌細(xì)胞有分泌型卷曲相關(guān)蛋白5蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:分泌型卷曲相關(guān)蛋白5能夠在心肌細(xì)胞中表達(dá)。
　　第二部分血管緊張素Ⅱ?qū)π募〖?xì)胞肥

14、大中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表達(dá)的影響
　　目的:建立心肌細(xì)胞肥大模型，觀察在心肌細(xì)胞肥大過程中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)情況。
　　方法:購買出生2-3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后應(yīng)用AngⅡ在不同濃度、不同時(shí)間干預(yù)心肌細(xì)胞。應(yīng)用RT-PCR、Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)情況，應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞BNP表

15、達(dá)情況。
　　結(jié)果:在AngⅡ的干預(yù)下，心肌細(xì)胞分泌型卷曲相關(guān)蛋白5和BNP的表達(dá)隨著AngⅡ干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在mRNA和蛋白水平，分泌型卷曲相關(guān)蛋白5在AngⅡ10-6 mol/L干預(yù)48h后達(dá)到最高值(P＜0.05)。BNP蛋白水平隨AngⅡ濃度的升高和干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在AngⅡ10-6 mol/L干預(yù)48h后達(dá)到最高值(P＜0.05)。
　　結(jié)論:在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程中，sFRP5表達(dá)

16、明顯增加。
　　第三部分血管緊張素Ⅱ主要通過血管緊張素Ⅱ1型受體上調(diào)分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)
　　目的:建立心肌細(xì)胞肥大模型，觀察血管緊張素Ⅱ受體在心肌細(xì)胞肥大中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表達(dá)的作用
　　方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h
　　后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，之后應(yīng)用AngⅡ的不同受體阻斷劑干預(yù)心肌細(xì)胞。應(yīng)用RT-PCR、Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞中

17、分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)情況，應(yīng)用Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞BNP表達(dá)情況。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，替米沙坦(10μmol/L)+AngⅡ(10-6 mol/L)組中，分泌型卷曲相關(guān)蛋白5 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)，但是，較AngⅡ(10-6 mol/L)組相比，替米沙坦(10μmol/L)+AngⅡ(10-6mol/L)組分泌型卷曲相關(guān)蛋白5mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05

18、);而替米沙坦(10μmol/L)組分泌型卷曲相關(guān)蛋白5mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組無明顯變化(P＞0.05)。而PD123319(10μmol/L)+AngⅡ(10-6 mol/L)組較AngⅡ(10-6 mol/L)相比，分泌型卷曲相關(guān)蛋白5mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表達(dá)上調(diào)的過程中，AngⅡ AT1R發(fā)揮主要作用。
　　第四部分血管

19、緊張素Ⅱ上調(diào)心肌細(xì)胞分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表達(dá)的分子機(jī)制
　　目的:觀察Rho/ROCK、MAPK信號(hào)通路在分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表達(dá)中發(fā)揮的作用以及它們的關(guān)系。
　　方法:購買出生2-3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48h后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，用AngⅡ(10-6 mmol/L，48h)干預(yù)心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，Y27632用來阻斷Rho/ROCK通路，同時(shí)進(jìn)行分組:對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ

20、+Y27632組，Y27632組，觀察分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)。同時(shí)，用AT1R阻斷劑替米沙坦作用于心肌細(xì)胞，分為對(duì)照組、AngⅡ組、AngⅡ+替米沙坦組、替米沙坦組，觀察心肌細(xì)胞p-MYPT1，總MYPT1的表達(dá)情況。之后分別應(yīng)用SB203580、PD98059及SP600125阻斷p38 MAPK、ERK1/2、JNK通路，觀察分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)情況;同時(shí)應(yīng)用ROCK抑制劑Y27632作用于心肌細(xì)胞，分為對(duì)照組、AngⅡ組

21、、AngⅡ+Y27632組、Y27632組，觀察p-JNK，總JNK的表達(dá)情況。應(yīng)用real time-PCR、Western-Blot技術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的表達(dá)，Western-Blot技術(shù)檢測(cè)p-MYPT1，總MYPT1，p-JNK，總JNK的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:用Y27632干預(yù)心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞分泌型卷曲相關(guān)蛋白5的mRNA及蛋白表達(dá)水平較AngⅡ干預(yù)組相比均明顯降低，(P＜0.05)。應(yīng)用AngⅡ干預(yù)

22、心肌細(xì)胞后，總MYPT1及總JNK表達(dá)水平無明顯變化，但是，p-MYPT1，p-JNK水平明顯增加，p-MYPT1/總MYPT1，p-JNK/總JNK表達(dá)水平增加。應(yīng)用AT1R阻斷劑替米沙坦干預(yù)48小時(shí)后，p-MYPT1/總MYPT1水平明顯降低，(P＜0.05)。用Y27632干預(yù)心肌細(xì)胞后，p-JNK/總JNK表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:Rho/ROCK通路在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5表