1、食管癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，早期的轉(zhuǎn)移及侵襲是食管癌高死亡率的主要原因。黏著斑激酶(FAK)，是一個(gè)125 kD的非受體型酪氨酸激酶，多項(xiàng)研究中均證實(shí)，F(xiàn)AK在食管癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。近年來(lái)，F(xiàn)AK在腫瘤干細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞受到細(xì)胞外因子刺激后向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，細(xì)胞間連接減少，同時(shí)與細(xì)胞周?chē)|(zhì)粘連減少，細(xì)胞骨架重構(gòu)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力

2、增加。
　　蟾蜍靈(Bufalin)是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的具有抗腫瘤作用的洋地黃類(lèi)物質(zhì)。但是Bufalin在食管癌中的具體作用機(jī)制仍然不明確。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)Bufalin在食管癌中Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用作了大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)Bufalin可以通過(guò)下調(diào)ERK的磷酸化水平，發(fā)揮抗腫瘤作用。為了更好的了解食管癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，研究了Bufalin對(duì)食管癌中FAK活化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

3、的影響，從而進(jìn)一步探討B(tài)ufalin在食管癌中抗腫瘤的作用機(jī)制。
　　目的:
　　探討B(tài)ufalin對(duì)食管癌中FAK活化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。
　　方法:
　　1、RT-PCR方法檢測(cè)不同濃度Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞FAK、E-Cadherin、Vim mRNA表達(dá)的影響。
　　2、Western Blot方法檢測(cè)不同濃度Bufalin對(duì)ECA109細(xì)胞FAK活化水平及FAK、E-Ca

4、dherin、Vim蛋白表達(dá)的影響。
　　3、采用劃痕愈合和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度Bufalin對(duì)ECA109細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。
　　4、建立36只人食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞裸鼠原位移植瘤模型，隨機(jī)分為6組，即模型組、Bufalin低劑量組（0.5mg/kg，BL）、Bufalin中劑量組(1mg/kg，BM)、Bufalin高劑量組(1.5mg/kg，BH)、PF562271組（FAK抑制劑）

5、、高劑量Bufalin與PF562271組聯(lián)合應(yīng)用組(BP)，持續(xù)腹腔注射藥物30天。用藥期間觀察裸鼠飲食和精神狀態(tài)變化，記錄裸鼠體重和腫瘤大小數(shù)據(jù)。
　　5、用藥結(jié)束后處死全部裸鼠，測(cè)量腫瘤大小并計(jì)算腫瘤抑制率。
　　6、HE染色檢測(cè)各組裸鼠移植瘤腫瘤組織鏡下表現(xiàn)。
　　7、Real time-PCR檢測(cè)各組裸鼠移植瘤中FAK、E-Cadherin、Vim mRNA的表達(dá)。
　　8、免疫組化法檢測(cè)各組裸鼠移植瘤

6、中FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞FAK表達(dá)及活化水平的影響
　　RT-PCR結(jié)果表明Bufalin抑制FAK mRNA的表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照組，20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271組，F(xiàn)AK mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.276±0.046，1.154±0.027，0.619±0.0

7、26，0.556±0.0172，0.439±0.022，0.221±0.0206，0.210±0.0285，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，藥物干預(yù)組FAK相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western Blot結(jié)果表明Bufalin抑制FAK的活化。陽(yáng)性對(duì)照組，20，40，60，80，100 nmol/LBufalin及PF562271組，F(xiàn)AK的相對(duì)表達(dá)量分別為1.255±0.111，1.357±0.050,1.177±0

8、.065,1.278±0.099,1.239±0.196,1.199±0.106,1.188±0.094，藥物干預(yù)組與陽(yáng)性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);FAK活化水平的相對(duì)表達(dá)量分別為1.315±0.020，1.159±0.058，1.002±0.069，0.773±0.027，0.589±0.027，0.410±0.026，0.379±0.044，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，藥物干預(yù)組FAK活化水平的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，差異具有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞EMT的影響
　　RT-PCR結(jié)果表明Bufalin增加E-Cadherin mRNA的表達(dá)，降低VimmRNA的表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照組，20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271組，E-Cadherin mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.231±0.016，0.435±0.048，0.568±0.034,0.669

10、±0.025,0.842±0.031,0.939±0.036,0.948±0.027，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，藥物干預(yù)組相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Vim mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.852±0.051，0.682±0.025，0.567±0.034，0.431±0.047，0.300±0.016，0.212±0.024，0.190±0.022，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，藥物干預(yù)組的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

11、(P＜0.05)。Western Blot結(jié)果表明Bufalin增加E-Cadherin蛋白的表達(dá)，降低Vim蛋白的表達(dá)。陽(yáng)性對(duì)照組，20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271組，E-Cadherin的相對(duì)表達(dá)量分別為0.351±0.009，0.459±0.006,0.515±0.006,0.619±0.006,0.756±0.005,0.859±0.007，0.867±0.005，相對(duì)表達(dá)量逐漸增加

12、，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Vim蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.257±0.043，1.150±0.038，0.854±0.032，0.754±0.025，0.621±0.028，0.552±0.034，0.539±0.040，相對(duì)表達(dá)量逐漸減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、Bufalin對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌ECA109細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Bufalin可以抑制ECA109細(xì)胞的遷移

13、及侵襲。藥物干預(yù)組（20，40，60，80，100 nmol/L Bufalin及PF562271組）與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞劃痕距離由1.156±0.118增加至1.556±0.249，2.981±0.167，3.685±0.121，4.614±0.170，5.316±0.104，5.795±0.178;Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示穿過(guò)基底膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)由107.00±8.19下降至78.67±3.06，61.67

14、±3.06，42.67±3.512，24.33±2.517，10.33±3.215，9.00±2.65; Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示穿過(guò)基底膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)由127.67±8.02下降至102.33±4.51，87.33±7.10，73.00±4.58，57.33±2.52，39.00±3.61，37.33±2.52，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)中模型組、BL組、BM組、BH組、PF562271

15、組、BP組裸鼠飲食及精神狀態(tài)未見(jiàn)異常;用藥前后各組裸鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5、Bufalin對(duì)裸鼠食管鱗狀細(xì)胞癌移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　模型組、BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組裸鼠腫瘤體積分別為2.430±0.052cm3,2.378±0.042cm3,1.805±0.052cm3,1.722±0.072cm3，1.703±0.062cm3，1.128±0.064cm3腫瘤體積逐漸減小

16、，與模型組相比，BM組、BH組、PF562271組、BP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各用藥組的腫瘤抑制率分別為4.4％，45.6％，63.5％，65.2％，71.1％。
　　6、各組裸鼠原位移植瘤瘤組織HE染色鏡下特點(diǎn)
　　各組裸鼠原位移植瘤瘤組織HE染色切片，均呈低分化鱗狀細(xì)胞癌的特點(diǎn)，癌細(xì)胞異形性明顯，細(xì)胞形態(tài)多樣，排列成大小不等的實(shí)性巢，核大深染，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，核仁明顯，少見(jiàn)細(xì)胞間橋及角化。
　

17、　7、Bufalin對(duì)裸鼠食管鱗狀細(xì)胞癌原位移植瘤中FAK表達(dá)、活化水平及EMT的影響
　　Real time-PCR結(jié)果表明Bufalin可以降低FAK的表達(dá)，增加E-Cadherin的表達(dá)，降低Vim的表達(dá)。BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組，各組FAK mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，分別為0.956±0.015，0.677±0.041,0.516±0.019,0.480±0.015,0.343±0.022;各

18、組E-CadherinmRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，分別為1.137±0.140，1.840±0.095，2.593±30.127，2.600±0.151，3.245±0.100;各組Vim mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，分別為1.004±0.033，0.791±0.027，0.540±0.026，0.501±0.015，0.399±0.023，與模型組相比，BM組、BH組、PF562271組、BP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

19、。免疫組化結(jié)果表明Bufalin可以降低FAK的表達(dá)及活化，增加E-Cadherin的表達(dá)，降低Vim的表達(dá)。模型組、BL組、BM組、BH組、PF562271組、BP組免疫組化結(jié)果:FAK免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為49.20，46.70，36.35，24.60，20.10，6.05，F(xiàn)AK蛋白表達(dá)逐漸降低;FAK活化水平各組免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為46.90，40.50，31.15，26.00，22.80，15.65，F(xiàn)AK活化水平逐

20、漸降低;E-Cadherin免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為8.75，14.00，24.40，40.60，42.5，52.75，E-Cadherin蛋白表達(dá)逐漸增加;Vim免疫反應(yīng)積分平均秩次分別為51.00，47.90，36.40，21.10，20.20，6.40，Vim蛋白表達(dá)逐漸降低，與模型組相比，BM組、BH組、PF562271組、BP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、Bufalin可以抑制EC