1、華支睪吸蟲病是由華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）引起的一種人畜共患寄生蟲病。華支睪吸蟲病在我國流行極為廣泛，約有1500多萬感染者。由于華支睪吸蟲寄生在人或動物肝臟膽管和膽囊內(nèi)，患者或患畜因蟲體對膽管的機械性損傷和阻塞及蟲體分泌排泄物的刺激作用而引起膽管及其周圍炎癥，進而導(dǎo)致肝實質(zhì)萎縮、硬化、功能障礙及其他全身性癥狀。華支睪吸蟲蟲卵還可以引起結(jié)石，膽管上皮細胞增生可致癌變。華支睪吸蟲的感染不僅給人類健康帶來了造成威脅

2、，也危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟損。面對嚴峻的形勢，急需一種簡便快捷的快速診斷方法，可以對患者患畜盡早確診，對檢出的陽性患畜或者水產(chǎn)品也可以盡早采取切實有效的治療措施，降低損失。
　　1.基于nad2基因華支睪吸蟲PCR檢測方法的建立
　　本研究基于華支睪吸蟲線粒體DNA NADH脫氫酶亞基2基因(nad2)序列，設(shè)計合成一對特異性引物，建立了檢測華支睪吸蟲的普通PCR方法。實驗證明，該方法特異性較好，用姜片吸

3、蟲、蛔蟲、隱孢子蟲、球蟲、大腸桿菌為模板均不能擴增出任何條帶;敏感性高，可檢測到的華支睪吸蟲DNA最低量為186 fg/μL。
　　2.基于nad2基因華支睪吸蟲Real-time PCR檢測方法的建立
　　本研究基于華支睪吸蟲的nad2基因序列，設(shè)計了特異性的引物，經(jīng)過Real-time PCR擴增和對擴增體系及條件的優(yōu)化，采用SYBR@Green熒光染料法建立華支睪吸蟲的Real-time PCR檢測方法。本研究使用含有

4、nad2基因的重組質(zhì)粒pMD-nad2作為標準品繪制標準曲線，其相關(guān)系數(shù)為0.998。實驗結(jié)果表明，本方法特異性好，與姜片吸蟲、蛔蟲、隱孢子蟲、球蟲、大腸桿菌等病原體的DNA均無交叉反應(yīng);敏感性實驗結(jié)果表明，最低可檢測到的華支睪吸蟲DNA量為0.15 fg/μl，比普通PCR檢測方法的敏感性高了1000倍左右。用建立起來的兩種PCR方法對采集的202份糞樣DNA進行檢測，PCR檢測方法檢出陽性樣本1份，陽性率為0.49％。用Real-t

5、ime PCR檢測方法檢出陽性樣本2份，陽性率為0.99％。相比之下，Real-time PCR比普通PCR檢測方法表現(xiàn)出更高的靈敏度。
　　3.基于重組蛋白enolase華支睪吸蟲間接ELISA檢測方法的建立
　　本研究以華支睪吸蟲烯醇酶(enolase)重組蛋白為包被抗原，建立檢測華支睪吸蟲的間接ELISA方法。通過對反應(yīng)體系的優(yōu)化，結(jié)果表明，ELISA最佳工作條件為:抗原最佳包被質(zhì)量濃度為5 mg//L，37℃1 h再

6、4℃過夜;5％脫脂奶粉，37℃封閉1 h;待檢血清1∶100稀釋37℃孵育1 h;酶標二抗1∶5000稀釋，37℃孵育45 min; TMB顯色作用時間10 min;確定的陰陽性血清臨界值為0.253。所建立的ELISA方法特異性較好，可檢測犬華支睪吸蟲病陽性血清，與犬衛(wèi)氏并殖吸蟲病陽性血清、犬蛔蟲病陽性血清、犬弓形蟲病陽性血清、犬新孢子蟲病陽性血清均不發(fā)生反應(yīng)。該方法敏感性為1∶3200。重復(fù)性試驗中，批間批內(nèi)實驗變異系數(shù)均小于10％