1、目的：⑴建立敏感、特異的雙抗夾心ELISA法，檢測華支睪吸蟲病人糞樣中的排泄分泌抗原(excreted-secretory antigen，ES antigen)，用于測定人群中華支睪吸蟲的感染；⑵建立高特異、高靈敏的PCR方法，檢測魚肉中的華支睪吸蟲囊蚴DNA，應用于魚類食品的衛(wèi)生檢疫及華支睪吸蟲中間宿主的感染調查。
　　 方法：①對17株華支睪吸蟲單克隆抗體應用間接ELISA法確定其亞類，并用位點阻斷ELISA法，進行位點類

2、別分類；②采用單抗和單抗或單抗和多抗之間的二二配對實驗，以夾心ELISA法篩選最佳抗體組合；③比較常規(guī)雙抗夾心ELISA法和生物素-鏈親和素(Biotin-Streptavidin，BS)雙抗夾心ELISA法檢測ES抗原的敏感性，確定糞ES抗原的ELISA檢測系統(tǒng)；④通過對兩種糞ES抗原抽提方法BSA法和PBS法的對比實驗研究，確定最佳糞ES抗原的抽提方法；⑤通過檢測純化的ES抗原、模擬糞ES抗原、華支睪吸蟲病人糞樣和其他消化道寄生蟲病

3、人糞樣對建立的雙抗夾心ELISA方法進行敏感性和特異性的初步評估；⑥對以引物CS1F/CS1R建立的PCR體系中的Mg2+濃度、引物濃度和退火溫度進行優(yōu)化，確定最佳的PCR反應條件；⑦通過檢測華支睪吸蟲囊蚴DNA和其他吸蟲成蟲的DNA對引物為CS1F/CS1R和OP2/Cs的二組PCR反應體系進行敏感性和特異性分析；⑧對比研究蛋白酶K簡單消化法、煮沸法和消化-煮沸法等三種DNA抽提方法，建立從感染華支睪吸蟲囊蚴的魚肉中抽提DNA的最佳方

4、法；⑨通過檢測31條華支睪吸蟲陽性麥穗魚和31條陰性魚對建立的PCR檢測方法進行初步評估。
　　 結果：⑴17株華支睪吸蟲單抗分成兩類單抗亞類，其中Cs30和Cs32兩株單抗屬于IgM，其余15株為IgG1；單抗識別抗原位點也分成兩類，其中Cs30、Cs13、Cs17、Cs51和Cs32五株單抗識別同一抗原表位，其余12株單抗(包括Cs63)則識別另一相同的抗原表位；⑵對17株單抗中效價最高的Cs32和Cs63進行特異性評估，兩

5、株單抗均不與血吸蟲成蟲粗抗原、血吸蟲蟲卵抗原以及衛(wèi)氏并殖吸蟲成蟲粗抗原發(fā)生交叉反應，表現(xiàn)出對華支睪吸蟲高度的特異性；⑶通過二二抗體配對試驗篩選出最佳抗體夾心組合為單抗+多抗；⑷在同樣的單抗包被(Cs32或Cs63)條件下，BS-ELISA檢測系統(tǒng)比HRP-ELISA檢測系統(tǒng)更敏感，可用于糞ES抗原檢測；⑸確定BS-ELISA檢測方法檢測華支睪吸蟲糞ES抗原，抽提糞ES方法為PBS法，包被抗體為Cs63；該系統(tǒng)可檢測到23.4ng的糞ES

6、抗原；⑹應用建立的生物素-鏈親和素雙抗夾心ELISA檢測方法檢測華支睪吸蟲病人的敏感度為80.9％，其中對每克糞蟲卵數(shù)(EPG)大于500的中高感染度的華支睪吸蟲病人能夠100％檢出；檢測蛔蟲、血吸蟲、鞭蟲、鉤蟲等其他寄生蟲病人的糞樣以及正常人糞樣，僅與蛔蟲(13％)、鞭蟲(10.5％)病人糞樣有部分交叉反應，檢測正常人糞樣有9.4％的假陽性；⑺經(jīng)優(yōu)化，以CS1F/CS1R為引物的PCR體系最佳反應條件是：引物濃度為0.67uM、Mg2

7、+濃度為1.5-2.0 mM，退火溫度為53.5℃；⑻特異性引物CS1F/CS1R可從華支睪吸蟲囊蚴和成蟲DNA中擴增出283bp的特異性片段，另一特異性引物OP2/Cs則擴增出301bp的特異性片段；兩對引物對宮川棘口吸蟲、抱莖棘隙吸蟲、東方次睪吸蟲、日本血吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲等基因組DNA均未擴增出任何條帶；結果表明，兩對引物具有對華支睪吸蟲高度的特異性；⑼引物為CS1F/CS1R的PCR檢測體系最低能檢測到0.67個C.s囊蚴，引物

8、為OP2/Cs時則能檢測出4×10-5個C.s囊蚴，敏感性優(yōu)于CS1F/CS1R的PCR檢測體系，可用于魚肉中的華支睪吸蟲囊蚴DNA的檢測；⑽確定以消化-煮沸法從感染華支睪吸蟲囊蚴的魚肉中抽提囊蚴DNA，DNA提取液最佳用量為10-15μl；⑾應用經(jīng)優(yōu)化的PCR檢測方法檢測31個華支睪吸蟲陽性魚樣品均擴增出301bp的特異性條帶，陽性檢出率為100％；31個陰性樣品，均未擴增出特異性條帶，假陽性率為0。
　　 結論：①本研究建立

9、的生物素-鏈親和素雙抗夾心ELISA檢測方法檢測糞ES抗原具有較高的敏感性和特異性，對測定人群中華支睪吸蟲的感染具有一定的應用前景；②引物CS1F/CS1R和OP2/Cs對華支睪吸蟲DNA都具有高度的特異性，并且引物OP2/Cs具有更高的敏感性，能檢測到4×10-5個C.s囊蚴；③建立了從感染華支睪吸蟲囊蚴的魚肉中抽提囊蚴DNA的方法(消化-煮沸法)，并用于引物為OP2/Cs的PCR檢測方法，檢出率100％，假陽性率0，有望應用于魚類食