1、目的：
　　本研究結(jié)果表明乳腺癌細(xì)胞中miR-107下調(diào)SIAH1的表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-107可致使SIAH1表達(dá)減少，促進(jìn)細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲并且能抑制細(xì)胞凋亡。相反，當(dāng)我們在乳腺癌細(xì)胞中沉默miR-107的表達(dá)可導(dǎo)致SIAH1表達(dá)增加，降低三陰乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)外的致瘤性。
　　材料與方法：
　　1、倫理學(xué)聲明
　　動物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言的道德標(biāo)準(zhǔn)和國家、國際準(zhǔn)則進(jìn)行，并已獲得中國醫(yī)

2、科大學(xué)倫理審查委員會準(zhǔn)許。
　　2、乳腺癌組織
　　本研究采用了38對原發(fā)性乳腺癌組織和其相應(yīng)的癌旁非腫瘤組織，均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1月至12月乳腺癌外科手術(shù)切除標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接收放、化療，且均已簽署知情同意書。收集的乳腺癌組織立即儲存在-80℃冰箱中備用。
　　3、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和乳腺正常上皮細(xì)胞MCF-10A培養(yǎng)在含10％胎牛血清和1％青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)

3、基中;三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)在10％胎牛血清和1％青-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中。三種細(xì)胞均培養(yǎng)在37℃、5％CO2的孵箱中。
　　4、qRT-PCR
　　用RNAiso（TaKaRa公司）從人乳腺癌組織和細(xì)胞中提取總RNA。One StepPrimeScript(R)miRNA cDNA合成試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。SYBR(R)Premix ExTaqTMⅡ(TaKaRa)檢測miR-107的表

4、達(dá)情況（使用Applied Biosystems7900HTFast Real-Time PCR系統(tǒng)）。以RNU6b標(biāo)準(zhǔn)化使用ΔΔCT方法量化miR-107的表達(dá)。MiR-107和RNU6b的特異性PCR引物分別由Invitrogen和TaKaRa公司合成。RNU6b為內(nèi)參對照。以配對癌旁乳腺組織中miR-107的表達(dá)水平作為基準(zhǔn)(=1)。
　　5、Westem Blot
　　用含有1mM PMSF的RIPA裂解緩沖液從人乳

5、腺癌組織和細(xì)胞中提取額總蛋白，然后電泳（10％ SDS-PAGE分離），并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2小時，分別孵育特異性一抗SIAH1（Santa Cruz Biotechnology公司）、β-actin(ZSGB-Bio公司)，4℃過夜，分別孵育相應(yīng)二抗2小時， ECL（賽默飛世爾科技）顯示。結(jié)果經(jīng)自動凝膠成像分析儀采集，進(jìn)行灰度值測定。
　　6、試劑
　　MIR-107 mimics、miR-107 inhibitor、

6、miR-107 antagomir及NC miR-mimics、NC miR-inhibitor、NC miR-antagomir由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成。SIAH1表達(dá)載體(pcDNA3-myc-SIAH1)由Dr Matsuzawa Shu-ichi[13，14](Burnham Institute，La Jolla, CA，USA)友情贈送。 SIAH1 siRNA廣州市銳博生物技術(shù)公司設(shè)計并合成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofec

7、tamine2000(Invitrogen)根據(jù)制造商的說明書使用。
　　7、雙熒光素酶報告基因檢測
　　野生型或突變體SIAH1-3'UTR熒光素酶報告載體由上海GeneChem有限公司設(shè)計并合成。MCF-7細(xì)胞接種于96孔板24小時，轉(zhuǎn)染前達(dá)80％匯合度。將600ng野生型或突變型SIAH1-3'UTR螢光素酶報告基因載體、40 pmol miR-107mimics或NC miR-mimics和10 ng pRL-TK載

8、體（含有海腎熒光素基因）共轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時后使用Dual-Luciferase(R)Reporter Assay System(Promega)檢測螢火蟲和海腎螢光素酶活性。以海腎螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲螢光素酶活性以控制轉(zhuǎn)染效率。
　　8、MTT法檢測細(xì)胞增殖
　　轉(zhuǎn)染后24小時將單細(xì)胞懸液接種在96孔板（每孔3×103個細(xì)胞）。每孔加MTT避光孵育4小時，加入DMSO，用酶標(biāo)儀測定570nm波長下的吸光

9、度值，每天一次共檢測四次。繪制細(xì)胞增殖曲線。
　　9、集落形成實(shí)驗(yàn)
　　轉(zhuǎn)染后24小時，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，在含10％胎牛血清的DMEM或L15培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至形成肉眼可見的菌落。用預(yù)冷甲醇固定細(xì)胞集落，蘇木素染色，洗滌并空氣干燥。
　　10、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期和凋亡
　　使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析，轉(zhuǎn)染后48小時收集1×106個細(xì)胞固定在500μl70％冷乙醇中4℃過夜。離心收集固定細(xì)胞加入100μ1

10、 RNaseA37℃水浴30分鐘，然后加入400μl碘化丙啶混勻（凱基生物科技有限公司），4℃放置30分鐘內(nèi)上機(jī)檢測。
　　轉(zhuǎn)染48小時后收集1～5×105細(xì)胞使用AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。
　　11、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，在transwell小室下室加入600μ1含20％胎牛血清的DMEM或L15培養(yǎng)基，上室加入100μ1含有2％胎牛血清DMEM或L15培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24

11、小時將3×104個MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞接種到上室。37℃、5％CO2的孵箱中孵育24小時后，除去培養(yǎng)基，PBS清洗后預(yù)冷甲醇固定15分鐘，用棉簽擦掉微孔膜上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥。取下微孔膜置于載玻片上顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。
　　細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，在transwell小室上室預(yù)涂一層稀釋的Matrigel(BD，Matrigel:MEM=1∶3)置于37℃、5％CO2孵箱中凝固。轉(zhuǎn)染后24小時將1×105個MC

12、F-7或MDA-MB-231細(xì)胞接種到上室。其他實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)一致。
　　12、動物實(shí)驗(yàn)
　　BALB/c無胸腺裸鼠從上海SLAC實(shí)驗(yàn)動物有限公司購買，養(yǎng)殖于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，條件達(dá)SPF級。1×107個MDA-MB-231單細(xì)胞懸浮接種到裸鼠右側(cè)腋窩的皮下組織中，建立三陰乳腺癌移植瘤模型。接種2周后，裸鼠被隨機(jī)分成兩組(n=6)。每只裸鼠按照10 nmolNC miR-antagomir或miR-107an

13、tagomir直接注射到移植瘤內(nèi)，瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，每四天一次共六次。使用游標(biāo)卡尺測定并計算得出移植瘤體積V=(L×W2)×0.5。
　　13、免疫組化
　　裸鼠移植瘤組織固定在4％多聚甲醛中，石蠟包埋和切片。多克隆山羊抗SIAH1抗體和多克隆小鼠抗i67抗體4℃孵育過夜。結(jié)果判定:SIAH1以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，Ki67以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色。
　　14、統(tǒng)計分析
　　Pearson相關(guān)檢

14、測方法分析miR-107和SIAH1之間的相關(guān)性。組間差異采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、miR-107在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增加，且與SIAH1的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)
　　乳腺癌組織中miR-107的表達(dá)顯著高于癌旁乳腺組織。而SIAH1在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁乳腺組織。Pearson相關(guān)分析顯示miR-107和SIAH1的表達(dá)之間存在顯著負(fù)相關(guān)性。對比人正常乳腺上皮細(xì)胞

15、MCF-10A，在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-107的表達(dá)顯著增加，而SIAH1的表達(dá)則明顯下降。
　　2、SIAH1是miR-107的一個下游靶點(diǎn)
　　過表達(dá)miR-107時僅在MCF-7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SIAH1表達(dá)顯著減少，MDA-MB-231細(xì)胞中SIAH1的表達(dá)改變不明顯;但是抑制miR-107表達(dá)時，在兩種乳腺癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)SIAH1表達(dá)明顯增加。雙熒光色素酶報告基因測試發(fā)現(xiàn)當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-

16、107mimics和野生型SIAH13'-UTR的報告基因載體時，熒光素酶活性降低;而當(dāng)共轉(zhuǎn)染miR-107 mimics和突變型SIAH13'-UTR的報告基因載體時，熒光素酶活性沒有變化。因此我們認(rèn)為miR-107通過與SIAH13'-UTR預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合來下調(diào)SIAH1的表達(dá)。
　　3、miR-107通過抑制SIAH1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和細(xì)胞周期進(jìn)程
　　在MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)miR-107

17、時可顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖和集落的形成;與此相反，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中沉默miR-107表達(dá)時能明顯抑制細(xì)胞的增殖和集落的形成。然而，當(dāng)SIAH1的表達(dá)幾乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平時，細(xì)胞增殖和集落形成也幾乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平。
　　過表達(dá)miR-107時細(xì)胞周期S期細(xì)胞所占百分比增加，而G1期細(xì)胞的百分比減少。與此相反，抑制miR-107表達(dá)時降低S期細(xì)胞的百分比而增加G1期細(xì)胞的百分比。然而，當(dāng)SIAH1的表達(dá)幾

18、乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平時，S期和G1期的百分比也幾乎恢復(fù)到對照組細(xì)胞水平。
　　結(jié)論：
　　1、miR-107在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)增加，且與SIAH1的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)
　　2、SIAH1是miR-107的一個下游靶點(diǎn)
　　3、miR-107通過抑制SIAH1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成和細(xì)胞周期進(jìn)程
　　4、miR-107通過下調(diào)SIAH1的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡且促進(jìn)其遷移和侵襲