1、原發(fā)性高血壓(primary hypertension)是臨床常見的一種慢性疾病，也是心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素，其主要并發(fā)癥如腦卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性腎病等，不僅致殘、致死率高，而且嚴(yán)重消耗醫(yī)療和社會(huì)資源，給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)，對(duì)人類健康危害較大，其發(fā)病機(jī)制目前仍不明確。近年來，隨著我國(guó)人口老齡化、生活水平的改善、生活節(jié)奏加快等因素，原發(fā)性高血壓發(fā)病率持續(xù)升高，且年輕患者比例顯著增多，原發(fā)性高血壓的預(yù)防和治療引起了研究者們

2、高度重視。血管損傷是高血壓疾病的基本病理改變之一，主要包括血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)等病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在高血壓的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。例如:高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，破壞其NO與內(nèi)皮素的分泌穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)血管收縮加強(qiáng)，從而增加了循環(huán)阻力，促進(jìn)高血壓的發(fā)展;在高血壓環(huán)境中，微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著升高，導(dǎo)致血液平行通路減少，提高了外周循環(huán)阻力，導(dǎo)致血壓升高。盡管越來越多的研究顯示，高血壓誘導(dǎo)的

3、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但其分子機(jī)理目前尚不明確，仍有待進(jìn)一步研究。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為18-24核苷酸左右的非編碼小分子RNA，其進(jìn)化呈高度保守，主要通過與靶基因mRNA的3□非翻譯區(qū)（區(qū)完全或不完全結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制蛋白質(zhì)翻譯或mRNA降解調(diào)控基因的表達(dá)。目前研究表明，高血壓患者外周血中miRNA表達(dá)譜發(fā)生了明顯改變，甚至具有高血壓早期診斷和預(yù)后判斷的臨床價(jià)值。此外，

4、在高血壓引起的并發(fā)癥中，miRNA也發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。此外，多種miRNA分子也參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。MiR-34a是一個(gè)多功能調(diào)控子，通過對(duì)相關(guān)靶基因的表達(dá)調(diào)控，參與細(xì)胞分裂、衰老、凋亡和增殖的調(diào)控。然而，miRNA-34a在高血壓中的表達(dá)及作用機(jī)制仍不明確。在本研究中，我們首先檢測(cè)miR-34a在高血壓病患者外周血表達(dá)情況及其與高血壓病臨床病理特征之間的關(guān)系;然后，從體外實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行深入研究，探討miR-34a在高血壓內(nèi)皮細(xì)

5、胞損傷中的作用及其機(jī)制，這可能為高血壓的臨床治療提供新的治療靶點(diǎn)。
　　目的：
　　研究miR-34a在高血壓患者外周血中的表達(dá)及在高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的分子調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　1.收集50例原發(fā)性高血壓患者外周血及28例正常健康人外周血，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá);
　　2.將miR-34a抑制物(miR-34a inhibitor)以及其陰性對(duì)照(scramble co

6、ntrol miRNA)分別轉(zhuǎn)入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中，轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行下一步檢測(cè)。
　　3.分別采用CCK-8、Transwell及流式細(xì)胞術(shù)研究miR-34a分子對(duì)HUVECs的增殖、細(xì)胞周期、凋亡和遷移能力的影響。
　　4.采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定Tgif2是否為miR-34a靶基因。
　　5.采用Western blot檢測(cè)下調(diào)miR-34a表達(dá)后，HUVECs中miR-34a潛在靶基因Tgif2的

7、表達(dá)。
　　6.采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，分組比較使用成組t檢驗(yàn)，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.MiR-34a在高血壓患者外周血中的表達(dá)及臨床意義
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，高血壓患者外周血中miR-34a的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在臨床病理特征分組比較中，高血壓3期患者外周血mi

8、R-34a表達(dá)明顯高于1期和2期患者(P＜0.05);這一結(jié)果表明，高血壓患者外周血中miR-34a的表達(dá)上調(diào)，且與高血壓進(jìn)展關(guān)系緊密。
　　2.MiR-34a對(duì)HUVECs增殖能力的影響
　　CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)miR-34a表達(dá)后，血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs的體外增殖能力明顯增強(qiáng)，表明miR-34a具有抑制HUVECs的增殖的功能，其在高血壓患者外周血中的高表達(dá)可能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
　　3.MiR-3

9、4a對(duì)HUVECs遷移能力的影響
　　Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)miR-34a表達(dá)后，HUVECs細(xì)胞遷移能力明顯升高，穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)多于NC組(74.5±4.30 vs48.5±6.3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);這一結(jié)果表明miR-34a能夠抑制HUVECs細(xì)胞遷移能力，在高血壓引起的血管內(nèi)皮損傷中，可能導(dǎo)致鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞向損傷處的遷移受抑，從而影響損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。
　　4.MiR-34a

10、對(duì)HUVECs細(xì)胞周期的影響
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-34a對(duì)HUVECs細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-34a inhibitor組的HUVECs出現(xiàn)了G1/S期轉(zhuǎn)換加快，表明過表達(dá)miR-34a能夠調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)換從而抑制HUVECs的增殖，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。
　　5.MiR-34a對(duì)HUVECs凋亡的影響
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后，人臍靜脈

11、內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P＞0.05)，表明在高血壓發(fā)生發(fā)展過程中，降低miR-34a的表達(dá)能夠抑制HUVECs細(xì)胞凋亡，可能是高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的作用機(jī)制之一。
　　6.Tigf2為miR-34a的靶基因
　　生物信息學(xué)分析顯示，miR-34a和Tgif2的3-UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，我們采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來確定Tgif2是否為miR-34a的直接靶基因。結(jié)果表明，與NC組相比，共轉(zhuǎn)染miR-34a mimi

12、cs和Tigf2-wild type熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒后，熒光值顯著下調(diào)(P＜0.05);而Tigf2-mutant與miR-34a mimics共轉(zhuǎn)后，熒光值并無明顯差異(P＞0.05)，表明miR-34a能與靶基因Tgif2 mRNA的3□-UTR種子區(qū)結(jié)合。免疫印跡結(jié)果顯示，下調(diào)miR-34a表達(dá)水平后，HUVECs中Tigf2蛋白表達(dá)均出現(xiàn)明顯上升(P＜0.05);提示miR-34a的生物學(xué)功能可能與Tigf2表達(dá)相關(guān)。