1、目的:通過(guò)對(duì)新生樹(shù)鼩接種低拷貝數(shù)的人HBV血清，優(yōu)化樹(shù)鼩慢性感染人HBV模型;通過(guò)觀察樹(shù)鼩感染HBV后體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ及TNF-α的表達(dá)情況，初步探討HBV感染過(guò)程中宿主的免疫反應(yīng)機(jī)制，以及通過(guò)調(diào)節(jié)免疫環(huán)節(jié)來(lái)優(yōu)化樹(shù)鼩感染HBV模型的可行性。
　　方法:
　　第一部分新生樹(shù)鼩感染人HBV模型的優(yōu)化，主要內(nèi)容有:新生樹(shù)鼩經(jīng)雙側(cè)大腿皮下接種低拷貝數(shù)(103copies/ml)人HBV血清，8周后定期以ELISA和PCR方

2、法動(dòng)態(tài)觀察樹(shù)鼩血清和肝組織中HBV感染標(biāo)志物的消長(zhǎng)，同時(shí)觀察樹(shù)鼩肝組織的病理改變。
　　第二部分分析樹(shù)鼩感染HBV后體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ及TNF-α的水平，主要內(nèi)容有:18只HBsAg和/或HBV DNA陽(yáng)性的樹(shù)鼩設(shè)為感染組，6只同期未接種HBV的正常樹(shù)鼩為對(duì)照組。對(duì)所有動(dòng)物的血清和肝組織標(biāo)本開(kāi)展如下檢測(cè):①應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)檢測(cè)免疫相關(guān)因子IFN-γ及TNF-α在肝組織中的mRNA表達(dá)水平;②應(yīng)

3、用免疫組織化學(xué)方法觀察肝組織中IFN-γ及TNF-α的表達(dá)情況;③應(yīng)用ELISA動(dòng)態(tài)觀察樹(shù)鼩接種HBV后第8、12、16、20、24和28周時(shí)外周血的IFN-γ及TNF-α水平的變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分觀察期內(nèi)28只新生樹(shù)鼩接種后的結(jié)果為:①血清ELISA結(jié)果顯示，自接種后第8周血清樣本均陸續(xù)檢出HBsAg陽(yáng)性(28/28，100％)，且呈持續(xù)波動(dòng)，HBsAg持續(xù)陽(yáng)性時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)22周，大部分動(dòng)物20周后HBsAg轉(zhuǎn)為

4、陰性;其中，8只(28.6％)不同時(shí)間出現(xiàn)HBsAb陽(yáng)性，呈一過(guò)性表現(xiàn);4只(14.3％)動(dòng)物可檢測(cè)到HBeAg陽(yáng)性;5只(17.9％)檢出HBeAb陽(yáng)性;2只(7.1％)檢出HBcAb陽(yáng)性。②血清或肝組織PCR結(jié)果顯示，自接種后第8周血清中即可檢測(cè)到低水平HBV DNA病毒拷貝數(shù)。此后，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒拷貝數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，直至接種后第24周，所有動(dòng)物血清中均檢測(cè)不到HBV DNA;肝組織中共9例(32.1％)樣本檢出HBV

5、DNA，且呈現(xiàn)低水平（101～103/ug肝組織總DNA），僅1只動(dòng)物血清和肝組織中同時(shí)檢出HBV DNA。③動(dòng)物肝組織HBcAg表達(dá)及主要病理改變有:HBcAg陽(yáng)性細(xì)胞可在多數(shù)動(dòng)物肝組織中(60.7％，17/28)表達(dá);大部分肝組織可見(jiàn)肝細(xì)胞濁腫，肝小葉內(nèi)可見(jiàn)少量單核或淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并有個(gè)別點(diǎn)狀壞死;小部分肝組織未呈現(xiàn)明顯病理及組織學(xué)改變。
　　第二部分18只感染組與6只正常對(duì)照組樹(shù)鼩免疫相關(guān)因子水平:①qRT-PCR

6、檢測(cè)結(jié)果表明，感染組IFN-γ mRNA表達(dá)水平（0.291±0.098）高于對(duì)照組（0.096±0.046），兩組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性;感染組TNF-αmRNA的表達(dá)水平（0.542±0.163）高于對(duì)照組（0.411±0.096），但兩組間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。②免疫組化結(jié)果顯示，兩組樹(shù)鼩肝組織內(nèi)IFN-γ蛋白的陽(yáng)性率分別為66.7％(12/18)和0％(0/6)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性; TNF-α蛋白在感染組和對(duì)照組樹(shù)鼩肝組織中的陽(yáng)性

7、率分別為88.9％(16/18)和16.7％(1/6)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。③ELISA動(dòng)態(tài)觀察外周血IFN-γ與TNF-α水平結(jié)果顯示，對(duì)照組樹(shù)鼩在任何時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到IFN-γ及TNF-α表達(dá);感染組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)IFN-γ與TNF-α雖均有低水平檢出，但都在試劑盒檢測(cè)閾值之下。
　　結(jié)論:
　　1.低拷貝數(shù)(103copies/ml)人HBV血清能避免接種后迅速激活宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)而清除病毒，提高樹(shù)鼩血清HBsAg的檢出

8、率及延長(zhǎng)HBsAb的出現(xiàn)時(shí)間，有望提高樹(shù)鼩慢性感染HBV率。
　　2.樹(shù)鼩在感染HBV過(guò)程中有與人類(lèi)相似的血清學(xué)轉(zhuǎn)換過(guò)程及肝臟病理變化，是研究人類(lèi)感染HBV相關(guān)領(lǐng)域的較理想的模型動(dòng)物。
　　3.感染HBV的樹(shù)鼩體內(nèi)免疫相關(guān)因子IFN-γ、 TNF-α的表達(dá)水平均高于正常樹(shù)鼩，提示樹(shù)鼩感染HBV后肝內(nèi)通過(guò)上調(diào)免疫相關(guān)因子的表達(dá)水平而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而在清除病毒以及影響病毒感染進(jìn)程起一定作用，即樹(shù)鼩感染HBV后可能具有與人類(lèi)相似