1、Pax6是眼發(fā)育過程中一種重要的轉錄調控因子，它包括兩個DNA結合區(qū)域(配對區(qū)和同源區(qū))和一個脯氨酸/絲氨酸/蘇氨酸(PST)富集區(qū)。Pax6基因對脊椎動物眼的結構發(fā)育和嗅覺細胞的分化都是必需的。Pax6基因有多種突變體，如人類的Pax6突變可導致多種表型突變，包括無虹膜，Peter's異常，常染色體顯性角膜炎，以及家族性的視網膜中央凹發(fā)育異常。目前檢測到的人類Pax6基因PST區(qū)的突變就有12種，其中10種都為截斷突變。
　　

2、 本實驗以花背蟾蜍鰓血循環(huán)期胚胎為材料，用RT-PCR法成功克隆得到了花背蟾蜍Pax6 variant基因開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)全序列基因，連接至pMD18-T克隆載體上后，酶切并克隆至pET-28a表達載體，測序后得到構建正確的原核表達載體。將正確的原核表達載體轉入Rosetta(DE3)表達宿主菌中，經過表達條件優(yōu)化后，得到最佳誘導條件為：誘導溫度20℃，IPTG濃度0.5 mM。在該條件下大量誘

3、導表達His-Pax6 variant融合蛋白，經His親和層析柱純化后，得到融合蛋白His-Pax6 variant。檢測蛋白純度及濃度后，以該蛋白為抗原，免疫昆明品系小鼠制備多克隆抗血清。并利用酶聯免疫吸附實驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay； ELISA)檢測抗血清效價，達到一定濃度后，眼球取血獲得小鼠抗花背蟾蜍多克隆抗血清。
　　 利用免疫親和層析法純化多克隆抗血清，利用酶聯免疫吸附實驗

4、檢測抗體靈敏性，并用Western Blot法檢測抗體的特異性。實驗表明純化后的抗體具有較高特異性。并用3D-PSSM軟件對花背蟾蜍Pax6野生型蛋白和Pax6 variant蛋白進行了二級結構預測，結果表明Pax6野生型蛋白和Pax6 variant蛋白具有相似的螺旋/折疊結構比。在Pax6野生型蛋白中，含有3％的β-折疊和25％的α-螺旋結構域，而在Pax6 variant蛋白中，則含有5％的β-折疊和20％的α-螺旋。在PST區(qū)P