1、艾滋病(AIDS)是一種由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的嚴(yán)重傳染病。目前，臨床治療AIDS的藥物主要有核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。我國(guó)目前尚無(wú)自主研發(fā)的此類(lèi)藥物上市，治療AIDS的藥物主要依靠從國(guó)外進(jìn)口。這些藥物價(jià)格都十分昂貴，一般患者很難支付得起，加之它們大都具有較強(qiáng)的毒副作用，長(zhǎng)期使用可產(chǎn)生耐藥性。因此，我國(guó)自行研制治療AIDS的藥物十分必要。天花粉蛋白(TCS)是中草藥天花粉的有效成分，入藥已

2、有兩千多年歷史，傳統(tǒng)中醫(yī)主要將其用于中期妊娠引產(chǎn)。近年來(lái)，隨著人們對(duì)TCS結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)它屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白(RIP)，具有多種生物活性和藥理活性。其生物活性主要包括：具有RNAN-糖苷酶活性，可以裂解核糖體28SrRNA上第4324位腺嘌呤堿基與核糖之間的N-糖苷鍵，而使真核細(xì)胞核糖體失活；具有類(lèi)似DNA酶活性，可以切割超螺旋DNA產(chǎn)生開(kāi)環(huán)和線(xiàn)性DNA；新近研究表明，TCS還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)趨化因子作用等。最被人們

3、看好的是其藥理活性，實(shí)驗(yàn)證明它可抑制某些腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)乙型肝炎病毒、麻疹病毒以及單純皰疹病毒等都有顯著抑制作用，其較強(qiáng)的抗HIV活性更是引起人們廣泛關(guān)注。因此，TCS在臨床、特別是在A(yíng)IDS治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而，作為人體的一種異己蛋白，TCS具有較強(qiáng)的免疫原性，在臨床試驗(yàn)及應(yīng)用中會(huì)產(chǎn)生一些如過(guò)敏反應(yīng)、神經(jīng)和腎臟毒性等副作用。此外，作為一種分子量不到27kD的蛋白質(zhì)，TCS在體內(nèi)的半衰期相對(duì)短暫，注入TCS后，它會(huì)很快被腎小球

4、過(guò)濾，丟失在尿液中，加之反復(fù)注射TCS產(chǎn)生抗體的破壞作用，以及血液內(nèi)蛋白酶的降解作用，其在體內(nèi)半衰期只有8.4～12.7min。如能設(shè)法將TCS可能引起的毒副反應(yīng)降到最低程度，同時(shí)延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，將更有助于增強(qiáng)其在臨床AIDS治療中的應(yīng)用潛力。現(xiàn)代分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展給改造蛋白多肽類(lèi)藥物提供了可能。通過(guò)分子生物學(xué)軟件分析，可預(yù)測(cè)蛋白多肽類(lèi)分子上可能的抗原決定簇位點(diǎn)，并可通過(guò)多種方法對(duì)其抗原性較強(qiáng)的位點(diǎn)進(jìn)行突變，以降低其免疫原性，

5、減少體內(nèi)副反應(yīng)。對(duì)于諸如體內(nèi)半衰期短等問(wèn)題，可通過(guò)采用多種藥物傳遞技術(shù)來(lái)提高蛋白多肽類(lèi)藥物的體內(nèi)療效，這其中最為成功的當(dāng)數(shù)PEG修飾(PEGylation)技術(shù)。目前已有多種不同的PEG分子可供選擇，也有多種不同的PEG修飾方法可供利用。其中，PEG定點(diǎn)修飾法，特別是巰基修飾法最為常用。通過(guò)PEG修飾，蛋白多肽類(lèi)藥物可降低免疫原性、改善藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)、降低體內(nèi)毒性以及增加藥物穩(wěn)定性等。本研究對(duì)TCS進(jìn)行了基因突變、表達(dá)和修飾，并對(duì)所獲得的T

6、CS及其衍生物的生物學(xué)和藥理學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，主要結(jié)果如下。1.借助計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)，定位了TCS分子上兩個(gè)可能的抗原決定簇，即YFF81-83和KR173-174。利用定點(diǎn)突變技術(shù)，分別將YFF81-83替換為81-83ACS、KR173-174替換為173-174CG，隨即產(chǎn)生三個(gè)突變型TCS，即TCSYFF81-83ACS、TCSKR173-174CG和TCSYFF81-83ACS-KR173-174CG(簡(jiǎn)單命名為M1、M2和M3

7、)。通過(guò)基因工程方法，實(shí)現(xiàn)了目的蛋白(即wTCS、M1、M2和M3)在原核系統(tǒng)內(nèi)的可溶性高效表達(dá)，并用Ni-NTA親和層析柱純化出所有目的蛋白。最后應(yīng)用PEG定點(diǎn)修飾技術(shù)，獲得了兩個(gè)PEG化的TCS，即PM1和PM2。此外，采用天然天花粉蛋白(nTCS)免疫家兔，制備了較高效價(jià)的抗TCS多克隆血清(效價(jià)1∶3,000)，為T(mén)CS及其衍生物的檢測(cè)創(chuàng)造了條件。2.對(duì)其DNA酶活性分析顯示，與nTCS一樣，所有構(gòu)建的TCS及其衍生物都顯示出類(lèi)

8、似DNA酶活性。進(jìn)一步對(duì)其致核糖體失活(RI)活性分析顯示，所有參與比較的TCS均顯示出RI活性。M1、M2和M3與nTCS相比，RI活性下降至1/3左右，而與表達(dá)的野生型天花粉蛋白(wTCS)活性相當(dāng)。可見(jiàn)造成這三個(gè)突變型TCS活性下降的根本原因存在于蛋白表達(dá)及純化過(guò)程中，而突變本身并沒(méi)有對(duì)其活性帶來(lái)影響。在各型TCS中，PM1和PM2的RI活性最低，是wTCS活性的1/9～1/6，推測(cè)這主要是PEG修飾造成的。3.免疫原性分析顯示，

9、與nTCS相比，M1、M2、M3以及PM1和PM2免疫小鼠后血清內(nèi)IgE水平均有不同程度降低，其中以PM1和PM2免疫后降低更為顯著，是nTCS刺激水平的1/4～1/3。小鼠血清內(nèi)IgG水平在M1、M2和M3免疫后均無(wú)顯著變化，而在PM1和PM2免疫后則有顯著降低。上述結(jié)果提示，本研究所預(yù)測(cè)的兩個(gè)抗原決定簇表位很可能是IgE性質(zhì)的表位，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)。而在PM1和PM2免疫后引起的IgG水平下降，推測(cè)可能與其上偶聯(lián)的

10、PEG分子遮蔽了附近的IgG表位有關(guān)。4.急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠在接受不同種類(lèi)、不同劑量的TCS后，主要表現(xiàn)為一般中毒癥狀。與nTCS相比，PM1和PM2的LD50值增加約0.5～0.8倍，表明其毒性有所降低。除PM1和PM2外，其它形式的TCS與nTCS的LD50值基本近似，都在14mg/kg左右。結(jié)果提示，PEG修飾可減低TCS毒性。5.藥代動(dòng)力學(xué)研究顯示，與M1和M2相比，PM1和PM2在血循環(huán)內(nèi)的平均滯留時(shí)間(MRT)、分布

11、半衰期(T1/2α)和生物半衰期(T1/2β)均有不同程度增加，其中MRT增加約4.5～6倍之多。而血漿清除率(Clp)則明顯減少，減少至1/2左右。結(jié)果表明，經(jīng)PEG修飾后，TCS在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)顯著改善，主要表現(xiàn)為血漿半衰期明顯延長(zhǎng)，血漿清除率顯著降低。綜上所述，三個(gè)突變型TCS在免疫原性降低的同時(shí)，其生物活性也有所下降；兩個(gè)PEG化TCS免疫原性顯著降低，血漿半衰期明顯延長(zhǎng)，毒性也有所下降，但也存在著生物活性降低的問(wèn)題。通過(guò)