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![天花粉蛋白對(duì)宮頸癌Caski細(xì)胞DNMT1基因表達(dá)及酶活性的影響.pdf_第1頁(yè)](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/12/6638d076-48be-4358-88f0-4ea6f67fc8e8/6638d076-48be-4358-88f0-4ea6f67fc8e81.gif)
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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:研究反義 DNMT1對(duì)人宮頸癌 Caski細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)周期的影響,以及對(duì)Caski細(xì)胞中抑癌基因 APC(Adenomatous Polyposis Coli APC)的表達(dá)及其5ˊ端啟動(dòng)子區(qū) CpG島甲基化狀態(tài)的影響;研究天花粉(Trichosanthin,TCS)蛋白對(duì)宮頸癌 Caski細(xì)胞 DNMT1( DNA- methyltransferase,DNMT)基因的表達(dá)和酶活性的影響,并探討天花粉蛋白抗宮頸癌及去甲基作用的
2、分子機(jī)制,尋找新型去甲基化藥物。
方法:利用成功構(gòu)建的反義 DNMT1真核表達(dá)質(zhì)粒 pCMV-THM轉(zhuǎn)染 Caski細(xì)胞,G418篩選,RT-PCR和Western- blotting法鑒定低表達(dá) DNMT1的細(xì)胞株,MTT法、流式細(xì)胞術(shù)分析反義 DNMT1基因轉(zhuǎn)染對(duì) Caski細(xì)胞增殖的影響;RT- PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR、Western-blotting和甲基化特異性 PCR法研究反義 DNMT1基因轉(zhuǎn)染對(duì) Cask
3、i細(xì)胞 APC的表達(dá)及甲基化狀態(tài)的影響。應(yīng)用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR和Western-blotting分析檢測(cè)天花粉蛋白對(duì)宮頸癌 Caski細(xì)胞 DNMTI基因表達(dá)的影響;應(yīng)用DNMT1酶活性試劑盒檢測(cè)天花粉蛋白對(duì) DNMT1酶活性的影響。
結(jié)果:(1)成功獲得低表達(dá) DNMT1基因的Caski細(xì)胞株,細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示 DNMT1低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖有抑制作用,并能夠顯著增加 G1期的細(xì)胞數(shù)(由50.1%增加到58%)。
4、(2)轉(zhuǎn)染 pCMV-THM質(zhì)粒的Caski細(xì)胞中APC基因 mRNA表達(dá)水平升高3.45倍,同時(shí) APC蛋白表達(dá)水平也明顯升高;MSP法檢測(cè)發(fā)現(xiàn) DNMT1表達(dá)抑制導(dǎo)致 APC基因啟動(dòng)子區(qū)去甲基化。(3)經(jīng)20、40、80?g/ml天花粉蛋白處理24h后,Caski細(xì)胞中DNM1基因 mRNA表達(dá)水平分別降低了39%、72%、79%,其蛋白表達(dá)水平也隨著藥物濃度增高而明顯降低;用DNMT1活性試劑盒檢測(cè)顯示20、40?g/ml天花粉蛋
5、白對(duì) DNMT1酶抑制率分別是31.3%和56.7%。
結(jié)論:(1)在人宮頸癌 Caski細(xì)胞中DNMT1為高表達(dá),降低 DNMT1基因表達(dá)水平能抑制細(xì)胞的增殖,提示 DNMT1可作為宮頸癌治療的一個(gè)靶點(diǎn)。(2)Caski細(xì)胞低表達(dá) DNMT1能誘導(dǎo)啟動(dòng)子區(qū) CpG島去甲基化而使 APC基因表達(dá)上調(diào),從而恢復(fù)抑癌基因的功能。(3)天花粉蛋白去甲基化的作用可能是通過(guò)降低 DNMTs的表達(dá)和抑制DNMTs的活性而實(shí)現(xiàn)的。上述研究提
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