1、為了建立聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控方法。首先，參照天花粉蛋白的檢測(cè)方法、中國藥典要求及新藥注冊(cè)指導(dǎo)原則，并結(jié)合聚乙二醇天花粉蛋白(PEG-TCS)的性質(zhì)及其修飾過程在以下幾個(gè)方面對(duì)聚乙二醇天花粉蛋白進(jìn)行了質(zhì)控方法學(xué)研究并擬定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：HPLC考察樣品純度方法建立與驗(yàn)證；聚乙二醇染色法對(duì)聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中游離PEG檢測(cè)方法建立；聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中NaCNBH<,3>殘留考馬斯亮藍(lán)試劑法檢測(cè)方法建立及與

2、碘滴定法的比較；Lowry法測(cè)定聚乙二醇化天花粉蛋白中蛋白含量的專屬性考察；小鼠引產(chǎn)活性考察聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的體內(nèi)活性的生物活性測(cè)定方法建立等．然后，根據(jù)質(zhì)控方法學(xué)研究的結(jié)果及其他檢測(cè)項(xiàng)目參照藥典建立了聚乙二醇天花粉蛋白注射液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)項(xiàng)目并對(duì)三批樣品進(jìn)行了檢測(cè)：采用免疫印跡和聚乙二醇染色法對(duì)聚乙二醇化天花粉蛋白進(jìn)行鑒別；用還原型SDS-PAGE法測(cè)定聚乙二醇化天花粉蛋白相對(duì)分子量；采用考馬斯亮藍(lán)試劑法對(duì)聚乙二醇化天花

3、粉蛋白注射液中NaCNBH<,3>殘留進(jìn)行檢測(cè)；采用聚乙二醇染色法對(duì)聚乙二醇化天花粉蛋白注射液中游離PEG進(jìn)行了檢測(cè)；利用非還原型SDS-PAGE法、SEC-HPLC法對(duì)聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的純度進(jìn)行了測(cè)定；小鼠引產(chǎn)活性考察聚乙二醇化天花粉蛋白注射液的體內(nèi)活性，聚乙二醇化天花粉蛋白注射液外觀、裝量、等電點(diǎn)、紫外掃描、pH、細(xì)菌內(nèi)毒素、無菌等其它指標(biāo)按照《中國藥典》三部的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。 HPLC考察純度色譜條件下，PEG-T

4、CS與TCS的分離度良好(≥ 2.0％)，回歸方程為A=307.53C-371，r=0.9983表明TCS在5～50μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，測(cè)得三批樣品中殘留的TCS均≤5μg/ml；非還原型SDS-PAGE電泳后采用聚乙二醇染色測(cè)得游離PEG殘留量小于15μg/ml；Lowry法測(cè)得蛋白質(zhì)含量為1.0mg/ml±0.15mg/ml，考馬斯亮藍(lán)試劑法檢測(cè)NaCNBH<,3>殘留經(jīng)方法學(xué)考察符合要求，且樣品中無NaCNBH<,3

5、>殘留，小鼠引產(chǎn)試驗(yàn)表明，經(jīng)過PEG修飾后的TCS引產(chǎn)活性加強(qiáng)。聚乙二醇化天花粉蛋白的鑒別實(shí)驗(yàn)中的免疫印跡和聚乙二醇染色均為陽性，還原SDS-PAGE法測(cè)得聚乙二醇化天花粉蛋白相對(duì)分子量為54KD±5.4KD，聚乙二醇化天花粉蛋白注射液成品是無色澄明的液體，無肉眼可見不溶物，裝量不少于1.0 ml/支，符合《中國藥典》三部附錄Ⅰ A中對(duì)裝量的要求。pH值為3.0～5.5，無菌實(shí)驗(yàn)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均陰性符合成品注射劑檢測(cè)規(guī)定要求。