1、類鼻疽(Melioidosis)是由類鼻疽桿菌（Burkholderia pseudomallei，全稱為類鼻疽伯克霍爾德氏菌）所引起的一種人獸共患傳染病。該疾病可通過呼吸道、消化道、經(jīng)皮傳播，主要侵犯人體肺部，可造成肺炎、肺膿腫以及肺部空洞，還可引起皮膚、肝臟、脾臟等多器官膿腫，嚴重者可快速發(fā)展為敗血癥，由于其診斷難、致病強、治療難、潛伏長，死亡率高達40％;其流行區(qū)域主要集中分布在南、北緯二十度內(nèi)，涵蓋澳大利亞、新加坡、越南、柬埔寨

2、、老撾、馬來西亞、泰國東北部等地區(qū)以及我國海南、香港、臺灣、廣東等南海及臺海等主要戰(zhàn)略方向，現(xiàn)越來越多的證據(jù)表明它是一種正在擴散的人獸共患傳染病。海南國際旅游島的開發(fā)、“一帶一路”的建設(shè)以及南海海洋主權(quán)維權(quán)和經(jīng)濟安全保障等已上升至國家戰(zhàn)略要求，加強類鼻疽研究具有重要的社會意義和軍事價值。深入研究B.pseudomallei感染致病機理、發(fā)展新的有效的B.pseudomallei感染治療手段迫在眉睫。
　　B.pseudomalle

3、i作為胞內(nèi)感染病原菌，有效逃逸機體免疫清除是B.pseudomallei感染與致病的前提。天然免疫作為人體抵御病原微生物侵襲的第一道防線，在抗感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自噬作為天然免疫中重要的組成部分，同時也作為機體自我保護的生理學行為，在抗病原微生物感染以及其導致的炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在類鼻疽桿菌的自噬研究中，早期發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染可誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生自噬，但隨著感染的持續(xù)，自噬出現(xiàn)抑制，RAW2

4、64.7細胞對B.pseudomallei清除能力減弱。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，B.pseudomallei感染肺上皮細胞A549后，自噬水平較未感染組明顯減弱;通過mRNA表達譜芯片篩選發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因ATG10下調(diào)最顯著。那么，B.pseudomallei是如何調(diào)控及抑制自噬，以利于其在宿主細胞中的存活和復(fù)制，使得機體不能有效清除B.pseudomallei，從而導致持續(xù)性感染的呢？
　　miRNAs作為病原與宿主相互作用的信號

5、調(diào)節(jié)分子，可通過介導清除病原體的自噬反應(yīng)，發(fā)揮抗病原微生物的感染免疫調(diào)節(jié)作用。為了探究B.pseudomallei感染過程中調(diào)控自噬的具體機制，以及miRNAs是否參與、如何參與自噬調(diào)節(jié)的分子機制，我們以肺上皮細胞A549為細胞模型，開展了B.pseudomallei感染A549細胞后miRNA表達譜芯片的篩選，對上調(diào)的miRNA進行生物信息學分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種未被報道的miRNAs: MIR4458、MIR4667-5p、MIR466

6、8-5p，它們可在3個不同的感染時間點分別靶向自噬信號通路的關(guān)鍵分子ATG10，提示我們B.pseudomallei可能通過改變宿主細胞的miRNAs表達譜，干擾宿主細胞自噬，實現(xiàn)逃避機體免疫清除的目的。因此，明確這些miRNAs介導的自噬抑制在類鼻疽桿菌感染免疫逃逸中的機制，將有助于開發(fā)作用于miRNAs或其靶標的新的治療手段，尤其是針對類鼻疽桿菌此種耐藥性強、胞內(nèi)感染的病原，臨床意義更為重要。
　　研究目的：
　　1.明

7、確B.pseudomallei感染A549細胞后自噬受抑的生物學現(xiàn)象;
　　2.明確B.pseudomallei感染A549細胞后自噬相關(guān)蛋白ATG10的表達變化;
　　3.探討MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p負性調(diào)控自噬的具體機制以及對細胞清除胞內(nèi)B.pseudomallei的影響;
　　4.探討B(tài).pseudomallei感染對MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p轉(zhuǎn)錄

8、調(diào)控的分子機制。
　　研究方法：
　　1.B.pseudomallei感染A549細胞后對細胞自噬的影響
　　首先建立B.pseudomallei感染A549細胞模型，通過透射電鏡、Western blot、激光共聚焦檢測B.pseudomallei感染A549細胞后細胞自噬水平變化情況;再者，藥物激活或抑制自噬的條件下，通過細菌胞內(nèi)計數(shù)實驗評價自噬對A549細胞清除胞內(nèi)B.pseudomallei能力的影響。

9、　　2.B.pseudomallei感染A549細胞自噬相關(guān)基因ATG10下調(diào)特點研究
　　通過mRNA表達譜芯片篩選，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白ATG10下調(diào)最明顯;結(jié)合表達譜芯片篩選結(jié)果，在mRNA和蛋白水平分析ATG10的時空表達特點;同時，構(gòu)建ATG10真核表達質(zhì)粒，回復(fù)下調(diào)的ATG10后，觀察并檢測自噬和細菌清除的變化。
　　3.MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p通過ATG10介導抑制自噬的機制研究<

10、br>　　結(jié)合miRNA表達譜芯片篩選和生物信息學預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p可靶向自噬相關(guān)基因ATG10;首先構(gòu)建熒光素酶報告載體進一步鑒定ATG10是MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的靶基因;分別過表達或抑制MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p，通過Western blot、激光共聚焦以及胞內(nèi)細菌計數(shù)實驗觀察miRNAs對自噬和細菌清除的影響

11、。
　　4.B.pseudomallei感染549細胞后上調(diào)MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機制研究
　　利用UCSC生物信息學軟件分析和預(yù)測MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)均含有較大的CpG島;首先通過BSP和DNMT活性檢測，觀察B.pseudomallei感染后MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的

12、CpG島甲基化水平改變;再者，利用去甲基化藥物5-Aza-CdR處理，通過MSP和qRT-PCR實驗，檢測降低甲基化水平對MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p表達的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.B.pseudomallei感染A549細胞后自噬受抑
　　通過透射電鏡、Western blot、激光共聚焦實驗，發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染A549細胞后自噬受抑;另外，在誘導或抑制自噬的條件

13、下，通過胞內(nèi)細菌計數(shù)實驗發(fā)現(xiàn)激活自噬可以增強宿主細胞對B.pseudomallei的胞內(nèi)清除能力。
　　2.B.pseudomallei通過下調(diào)ATG10抑制自噬
　　通過mRNA表達譜芯片篩選，發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染后自噬相關(guān)蛋白ATG10下調(diào)最明顯;利用qRT-PCR和Western blot實驗分析，ATG10在mRNA和蛋白水平上均發(fā)生明顯下調(diào);同時，過表達ATG10可增強細胞自噬以及對B.pseudo

14、mallei的胞內(nèi)清除能力。
　　3.B.pseudomallei通過上調(diào)MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p抑制自噬
　　通過生物信息學分析以及雙熒光素酶報告實驗、Western blot及qRT-PCR實驗，預(yù)測并鑒定了ATG10是MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p的靶基因;分別過表達或抑制這3個miRNA后，發(fā)現(xiàn)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p通過

15、ATG10介導了抑制宿主細胞自噬以及對B.pseudomallei胞內(nèi)清除能力。
　　4.B.pseudomallei感染后引起的MIR4458、MIR4667-5p、MIR668-5p啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平降低與其表達調(diào)控有關(guān)
　　通過BSP和DNMT活性檢測，發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei感染后MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的CpG島甲基化水平降低;同時，去甲基化藥物5-Aza-CdR

16、處理后，MSP分析MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的CpG島發(fā)生去甲基化，進一步qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的表達均增加。
　　研究結(jié)論：
　　B.pseudomallei感染可通過甲基化調(diào)控方式，誘導MIR4458、MIR4667-5p和MIR4668-5p的上調(diào)，進而實時、連續(xù)的抑制其靶基因ATG10的表達，負性調(diào)控自噬，從而影響宿主細胞對B.