1、蛋白質(zhì)的可逆磷酸化作用作為一種調(diào)節(jié)機(jī)制在生物體中發(fā)揮重要作用。在信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制、細(xì)胞分裂與分化等多種生理過程中，許多重要蛋白質(zhì)和酶的生物活性都被磷酸基團(tuán)的可逆加合即磷酸化和去磷酸化所調(diào)節(jié)。 傳鐵蛋白是一大類遺傳相關(guān)、生物功能相似、結(jié)構(gòu)類似的非血紅素鐵結(jié)合蛋白。主要包括血清鐵傳運(yùn)蛋白(serum transferrin，TF)、乳鐵傳運(yùn)蛋白(lactotransferrin，LF)、卵傳鐵蛋白(ovotransfe

2、rrin，OTF)。分子量約為70～80kDa，由單一肽鏈組成并構(gòu)成兩個(gè)功能相似的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域分別以2個(gè)Tyr、1個(gè)Asp和1個(gè)His結(jié)合1個(gè)Fe3+，另有1個(gè)CO2-3作為協(xié)同陰離子。它們的主要生理功能是負(fù)責(zé)運(yùn)輸鐵和協(xié)助調(diào)節(jié)機(jī)體中鐵的平衡。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，傳鐵蛋白家族中的某些乳傳鐵蛋白和鐵結(jié)合蛋白(細(xì)菌中的傳鐵蛋白)具有磷酸(酯)酶的功能，因此，研究傳鐵蛋白磷酸(酯)酶學(xué)功能位點(diǎn)和作用機(jī)制并進(jìn)一步確定它們?cè)诹姿峄^程的作用具有重要意

3、義。 本課題利用31P NMR及UV-Vis、ESI-MS、ICP-AES等技術(shù)，測(cè)定了人血清脫金屬傳鐵蛋白(apo-hTF)及牛奶乳傳鐵蛋白與焦磷酸(PPi)及ATP反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，研究了該酶促反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)制。 在10mmol·L-1 pH7.4 Hepes緩沖液中，312K溫度下，PPi與apo-hTF反應(yīng)時(shí)，5～10h后其31P NMR圖譜上在約3.74ppm處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)于磷酸根的新信號(hào)峰，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，對(duì)應(yīng)于P

4、Pi(-6.59ppm)峰的強(qiáng)度逐漸降低而對(duì)應(yīng)于Pi的峰強(qiáng)度逐漸增大，說明apo-hTF具有催化裂解焦磷酸鍵的酶學(xué)功能。根據(jù)不同時(shí)間PPi的濃度和微分法原理，通過作圖法發(fā)現(xiàn)該酶促反應(yīng)為二級(jí)反應(yīng)，當(dāng)[PPi]：[apo-hTF]=16：1、27：1、38：1、50：1時(shí)，表觀反應(yīng)速率常數(shù)分別為3.67x10-4、1.91×10-4、1.22x10-4、8.53x10-4L·mmol-1·h-1(pH7.40，312K)。用初速率法測(cè)定速率

5、常數(shù)為0.010382mmol·L-1·h-1(零級(jí)反應(yīng))。該酶促反應(yīng)米氏常數(shù)Km為3.600，vm為0.00864mmol·L-1·h-1。 在10mmol．L-1 pH7.4 Hepes緩沖液中，298K時(shí)，向apo-hTF溶液中滴加PPi，在UV-Vis差譜上于245nm處產(chǎn)生一個(gè)負(fù)吸收峰，峰強(qiáng)度隨著：PPi濃度的增加而下降。這與PPi和Tyr直接反應(yīng)的結(jié)果相似，說明PPi可通過氫鍵結(jié)合于apo-hTF中Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)

6、酪氨酸上(而His與PPi的結(jié)合卻很弱)。當(dāng)[PPi]：[apo-hTF]為2：1時(shí)結(jié)合達(dá)飽和，ICP-AES分析結(jié)果顯示每蛋白分子可結(jié)合3.5個(gè)P，證實(shí)了該結(jié)果。因此，可以推測(cè)apo-hTF催化裂解焦磷酸鍵的反應(yīng)分為兩個(gè)步驟：PPi先通過氫鍵結(jié)合于蛋白中Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)上，再發(fā)生催化水解反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ca2+對(duì)該酶促反應(yīng)具有微弱的催化作用，表觀反應(yīng)速率常數(shù)為2.31×10-4L·mmol-1·h-1(pH7.40，312K

7、)。 相同條件下，holo-hTF對(duì)PPi幾乎沒有作用，可能是因?yàn)閔olo-hTF中Fe3+的結(jié)合位點(diǎn)酪氨酸被封閉，PPi不能結(jié)合于該活性中心的緣故。Apo-hTF對(duì)ATP也沒有作用，也可能是由于ATP分子較大，不能進(jìn)入到apo-hTF中的活性中心的緣故。 與holo-hTF不同，乳鐵蛋白(LF)具有催化裂解焦磷酸鍵的酶學(xué)功能，反應(yīng)也遵循二級(jí)動(dòng)力學(xué)特征，當(dāng)[PPi]：[LF]=20：1、40：1、60：1、80：1、10

8、0：1時(shí)，測(cè)得表觀反應(yīng)速率常數(shù)分別為：3.45x10-4、2.42×10-4、1.36x10-4、3.30x10-5、2.50x10-6L·mmol-1·h-1(pH7.40，312K)。用初速率法測(cè)定反應(yīng)速率常數(shù)為0.00253mmol·L-1·h-1(零級(jí)反應(yīng))。該酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)Km為3.539，vm為0.026247mmol·L-1·h-1。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)apo-hTF、LF都有催化裂解PPi的磷酸(酯)酶功能，PPi首先