1、乳鐵蛋白的分離工藝研究乳鐵蛋白的分離工藝研究牛初乳是指奶牛產(chǎn)犢后3d內(nèi)所分泌的乳汁。科學研究證實，牛初乳是自然界因子最為富集的生物資源之一。包括重要的免疫因子和生長因子，如免疫球蛋白（IgG）、乳鐵蛋白（LF）及胰島素生長因子（IGF）等，含量比常乳高10～100倍。這些生理活性成分具有免疫調節(jié)、延緩衰老、促進生長發(fā)育、抑制腫瘤等生物功能，不僅可以制造功能保健食品，而且還具有開發(fā)天然活性生物藥物的巨大潛力。乳鐵蛋白又稱“乳轉鐵蛋白”，是

2、一種糖蛋白，屬于轉鐵蛋白家族。LF的一級結構是一條多肽鏈，分子量為70～80kD，LF上結合有兩條糖鏈，含量為7%左右，其組成包括有半乳糖、甘露糖、N－乙酰半乳糖胺、藻糖等。LF具有多種生物活性，如促進鐵的吸收、抑菌抗病毒、促進細胞增殖、調節(jié)骨髓細胞生成、調節(jié)補體系統(tǒng)、刺激溶菌酶再生、防止脂質過氧化等。在牛初乳中，乳鐵蛋白的含量為1.00mgml，比常乳高近50倍。我國約有乳牛近430萬頭，其中成年母牛260萬頭，以每頭乳牛年產(chǎn)初乳50

3、kg計算，每年可產(chǎn)近130t乳鐵蛋白，因此生產(chǎn)乳鐵蛋白的原料極為豐富，它的開發(fā)利用將帶來可觀的經(jīng)濟效益和社會效益。但牛初乳具有異味及粘稠度大，難于加工處理的特點，除喂養(yǎng)牛犢之外，利用率非常低。初乳本身所具備的潛在價值得不到充分的反映。因此，高效綜合利用牛初乳資源，開發(fā)出合理的分離技術路線以提取高純度、高活性的天然活性蛋白質，特別是開發(fā)生物藥原料有十分重要的現(xiàn)實意義。本實驗室通過離子交換色譜技術，成功地從初乳中分離出了高純度的乳鐵蛋白，并

4、對此分離過程做了適當?shù)膬?yōu)化，達到了低成本分離高純度乳鐵蛋白的目的。1原料與器材原料與器材1.1原料與試劑牛初乳：乳牛產(chǎn)犢3ｄ內(nèi)收集的樣品，CMSephadexC50：進口分裝BMK（Shanghai）Sci&TechLtd，CMSEPHAROSEFASTFLOW，LF標準樣品、電泳級丙稀酰胺Acr、電泳級甲叉雙丙稀酰胺Bis、分析純Tris堿（三羥甲基氨基甲烷），化學純SDS（十二烷基磺酸鈉），分析純TEMED（四甲基乙二胺），過硫酸胺

5、Ap，分析純甘氨酸，考馬斯亮藍R250等。1.2實驗儀器SBS100數(shù)控計滴自動部分收集器、HD2188核酸蛋白檢測儀、3057PTABLERECDER、BT01100蘭格恒流泵、TH500梯度混合器、PHS25型pH計、DYY8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYⅢ28A型電泳槽、751G分光光度計、TDL5000B冷凍離心機。2實驗方法實驗方法2.1分離方法2.1.1凝膠的預處理取液體膠與去離子水1：1混合，浸泡，沉降裝柱。以2BV的流速先用堿

6、洗2.5h（5倍膠體積），用去離子水洗至pH值為7.0左右，用酸洗2.5h，用水洗至pH值為7.0左右，再用堿洗2.5h，后用水洗至pH值7.0左右備用。2.1.2牛初乳的脫脂取新鮮牛初乳在冷凍離心機中離心30min（4800rmin，1～5℃），去上層油脂。2.1.3階躍洗脫的方法脂的分離效果。從表1可以看出，相同單位量的牛初乳原料進行實驗，CMSEPHADEXC50和CMSEPHAROSEFASTFLOW相比，洗脫得到的LF的量和純

7、度都相差不大，只是CMSEPHADEXC50得到的洗脫液呈較深粉紅色，而用CMSEPHAROSEFASTFLOW洗脫得到的洗脫液顏色略淺一些。使用相同的裝柱方法時，CMSEPHAROSEFASTFLOW比CMSEPHADEXC50更容易操作，且在實驗過程中體積不會發(fā)生變化，有利于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。同時由于裝柱過程對洗脫效果也有相當程度的影響，故后繼實驗選用CMSEPHAROSEFASTFLOW為交換劑。3.2吸附方法的選擇（見圖3）離子交

8、換色譜的吸附方法主要分為靜態(tài)吸附與動態(tài)吸附2類。靜態(tài)吸附需要的時間比較少，但是無法實現(xiàn)連續(xù)操作，只能停留在實驗室小規(guī)模提取階段，缺乏工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。而動態(tài)吸附比較容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，需要的時間一般隨原料的量而變化。2種吸附方法在后期的pH值基本保持穩(wěn)定，說明牛初乳具有良好的緩沖功能。由于靜態(tài)吸附后的吸附劑難于裝柱，故選用動態(tài)吸附法。3.3吸附速度的選擇由于在工業(yè)化生產(chǎn)中為了提高生產(chǎn)效率，必然在不影響產(chǎn)品得率的前提下降低生產(chǎn)周期。而牛初乳