1、目的:研究人C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子新基因ZNF580過表達(dá)對內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響,為闡明ZNF580基因的功能提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng),至EA.hy926細(xì)胞生長成單層后備用。
　　 2采用脂質(zhì)體法將真核表達(dá)載體pEGFP-ZNF580和pEGFP-C1導(dǎo)入EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞,

2、用含400μg/mlG418的完全培養(yǎng)基篩選并建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1,擴(kuò)大培養(yǎng)后用RT-PCR和Western Blot方法鑒定ZNF580基因的表達(dá)。
　　 3利用MTT比色法分析ZNF580對內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 4應(yīng)用基因芯片分析EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1細(xì)胞株的基因表達(dá)譜,并通過Rea

3、l Time-PCR方法驗(yàn)證19個(gè)差異基因。
　　 5生物信息學(xué)分析芯片結(jié)果,MEME算法對差異基因啟動(dòng)子區(qū)域中的一致性序列進(jìn)行計(jì)算;差異基因構(gòu)建信號通路圖。
　　 結(jié)果:
　　 1在熒光顯微鏡下可見,EA.hy926pEGFP-C1細(xì)胞,綠色熒光蛋白布滿內(nèi)皮細(xì)胞整個(gè)胞漿,而EA.hy926pEGFP-ZNF580細(xì)胞,融合有綠色熒光蛋白的ZNF580蛋白聚集于內(nèi)皮細(xì)胞核中。經(jīng)RT-PCR和Western Blo

4、t方法鑒定,通過轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞株EA.hy926pEGFP-ZNF58和EA.hy926pEGFP-C1。
　　 2基因芯片篩選差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)上調(diào)的基因有78個(gè)包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)、轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGFβ2)、成纖維生長因子1(FGF1)、成纖維生長因子(FGF2)、白介素8(IL8)、鋅指基因480(ZNF480),下調(diào)的基因有66個(gè),包括集落刺激因子2(CSF2)、乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2(

5、ACAT2)、SMAD1、基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP10)、ATP結(jié)合盒8(ABCA8)、Krüppel因子9(KLF9)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)等。差異表達(dá)基因的功能涉及內(nèi)皮細(xì)胞許多方面,包括細(xì)胞周期調(diào)控基因,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因,與血管生成和重塑相關(guān)基因,轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控基因及翻譯活性調(diào)控基因等。
　　 3 EA.hy926pEGFP-ZNF580細(xì)胞增殖活性顯著高于EA.hy926 pEGFP-C1細(xì)胞。
　　 4

6、MEME法預(yù)測出ZNF580所結(jié)合的九個(gè)堿基的一致性序列為CCAG[G/C]CTGG,該序列的E-value值最小,為1.1e-531。生物信息學(xué)分析,ZNF580在EA.hy926細(xì)胞株中,參與細(xì)胞周期和血管生成的調(diào)節(jié)方面,發(fā)揮了重要作用。
　　 結(jié)論:
　　 1成功建立ZNF580基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株EA.hy926 pEGFP-ZNF580和對照株EA.hy926pEGFP-C1。
　　 2應(yīng)用基因芯片技術(shù)分

7、析EA.hy926pEGFP-ZNF580和EA.hy926pEGFP-C1細(xì)胞株的差異表達(dá)基因,從芯片結(jié)果挑選10個(gè)上調(diào)表達(dá)和9個(gè)下調(diào)表達(dá)基因用Real Time-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果提示基因芯片結(jié)果假陽性率低,可信度高。
　　 3 ZNF580基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926后引起EA.hy926細(xì)胞基因表達(dá)譜廣泛改變。
　　 4 ZNF580可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926增殖。
　　 5對差異基因的分