1、冷馴化是一個由數(shù)百個基因協(xié)同調控的復雜的生物過程。在這個由眾多基因構成的調控網絡中，少數(shù)關鍵性調控基因控制著大量基因的表達。C-repeatbindingfactor(CBF)基因是冷誘導轉錄級聯(lián)反應的調節(jié)子，該基因的過表達植株表現(xiàn)出抗寒性的增強。本實驗以擬南芥野生型ArabidopsisthalianaC24為材料，從C24基因組中克隆CBF1(C-repeatbindingfactor1)全序列，連接到表達載體pCAMBIA1300

2、中，成功構建了CBF1的真核表達載體。此外，同時建立雞冠花組織培養(yǎng)再生體系，用于后期CBF1的遺傳轉化和抗凍性轉基因植株的獲得。主要內容如下： 1擬南芥CBF1基因的克隆與鑒定：根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的擬南芥CBF1基因序列，設計含有限制性內切酶XbaI和SacI酶切位點的上、下游特異引物，通過PCR獲得CBF1基因767bp全序列。將獲得的CBF1基因連接到pMD18-T載體中，用熱激法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，構建克隆載

3、體pMD18T-CBF1。通過藍白斑篩選、菌落PCR以及雙酶切鑒定，測序，挑取正確的克隆進行下一步操作。 2CBF1基因真核表達載體的構建：將pMD18T-CBF1和表達載體pCAMBIA1300均用XbaI和SacI雙酶切后回收目的基因CBF1和載體pCAMBIA1300，T4連接酶連接過夜，熱激轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，酶切鑒定獲得陽性克隆。將重組質粒pCAMBIA1300-CBF1熱激轉化農桿菌GV3101，鑒定后的陽性

4、菌株用于花卉植物的遺傳轉化。 3雞冠花再生體系的建立：以雞冠花頂芽為外植體，通過愈傷組織和不定芽的誘導建立了再生體系。分化培養(yǎng)基為：MS+2.0㎎/L6-BA+0.5㎎/LNAA+0.5㎎/LIAA，愈傷組織的誘導率為86.7％，不定芽的誘導率為71.7％。1/2MS培養(yǎng)基生根誘導，生根率為92％。為下一步CBF1基因的遺傳轉化奠定了實驗基礎。 我們成功克隆了CBF1基因并構建出CBF1真核表達載體，建立了雞冠花再生體系