1、目的：
　?、裥妥儜B(tài)反應(yīng)疾病是一類由IgE介導(dǎo)的過敏性疾病，主要包括支氣管哮喘，鼻炎，結(jié)膜炎等疾病。主要表現(xiàn)為大量表達(dá)Th2細(xì)胞因子、嗜酸粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤，同時引發(fā)炎性反應(yīng)。近年來Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率明顯升高,其受重視程度日益增強(qiáng)。Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病是一種需要從多角度多層面綜合性治療的疾病，而現(xiàn)階段對其尚沒有完善治療方法，它已成為一個全球性健康問題。近期大量研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性炎癥發(fā)病機(jī)制的過程中貫穿始終，起核

2、心作用。肥大細(xì)胞是速發(fā)型過敏反應(yīng)的初級效應(yīng)細(xì)胞，其激活直接影響次級效應(yīng)細(xì)胞—嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的募集和激活，是重要的調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，是介導(dǎo)速發(fā)型過敏和炎癥的重要樞紐，能引發(fā)和擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。同時，肥大細(xì)胞還參與了許多疾病和炎癥過程，特別是與一些變態(tài)反應(yīng)性疾病如蕁麻疹、銀屑病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生關(guān)系密切。但是對于肥大細(xì)胞活化的確切機(jī)制尚不清楚，調(diào)控肥大細(xì)胞活化的藥物也寥寥無幾，如果能夠深入探明肥大細(xì)胞在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)中作用機(jī)以及干預(yù)靶

3、點，尋找有效干預(yù)其活化的臨床治療方案，將有利于進(jìn)一步完善過敏性哮喘等相關(guān)疾病的防治策略。近年來發(fā)現(xiàn)氫分子作為一種新興的氣體信號分子，具有干預(yù)多種炎癥反應(yīng)（如急性胰腺炎、急性肺炎等）以及免疫調(diào)節(jié)作用，因此本研究以小鼠肥大細(xì)胞P815為研究對象，建立肥大細(xì)胞活化模型，從干預(yù)肥大細(xì)胞活化的角度探索氫氣飽和滅菌水治療Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病的潛在機(jī)制及靶點，為治療Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病提供新的思路。
　　方法：
　　肥大細(xì)胞(P815小鼠肥大細(xì)

4、胞株，購買來自美國)在1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中含有10％新生小牛血清，實驗設(shè)計分組：正?？瞻讓φ战M(Con組)、Anti-DNP-IgE模型組(Anti-DNP-IgE組)、氫氣飽和滅菌水治療組(Anti-DNP-IgE+H2組)、單純氫氣飽和滅菌水組(H2組)。通過MTT實驗確定了Anti-DNP-IgE的最適宜濃度及干預(yù)時間。通過對各組進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色從形態(tài)學(xué)角度揭示氫氣飽和滅菌水對于Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化是

5、否影響,初步觀察氫氣飽和滅菌水對Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化的影響；通過 ELISA試劑盒檢測肥大細(xì)胞活化的關(guān)鍵性的指標(biāo)包括組胺(HIS)，β氨基己糖苷酶(β-Hex)以及類胰蛋白酶(TPS)在各組中水平從免疫調(diào)節(jié)角度驗證氫氣飽和滅菌水對于Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化究竟有何種影響;從形態(tài)學(xué)角度應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)進(jìn)一步研究氫氣飽和滅菌水干預(yù)肥大細(xì)胞活化機(jī)制的三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激酶(Lyn、Syk、Fyn)與受體

6、(FceRIβ)結(jié)合情況。進(jìn)一步從分子角度探討氫氣飽和滅菌水調(diào)控肥大細(xì)胞活化的分子機(jī)制，Western Blot方法觀察氫氣飽和滅菌水是否干預(yù)肥大細(xì)胞活化機(jī)制的初始階段三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激酶(Lyn、Syk、Fyn)以及下游通路PI3K-AKT分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 Anti-DNP-IgE激活肥大細(xì)胞的最適干預(yù)時間和濃度。
　　通過MTT實驗確定Anti-DNP-IgE激活肥大細(xì)胞的最適宜濃度及

7、干預(yù)時間分別為1000ng／ml、10h。
　　2肥大細(xì)胞活化的甲苯胺藍(lán)染色形態(tài)學(xué)觀察。
　　正常對照與單純氫氣飽和滅菌水組無明顯改變，Anti-DNP-IgE模型組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分泌囊泡明顯增多，而氫氣飽和滅菌水治療組內(nèi)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)囊泡明顯減少。從形態(tài)學(xué)角度初步證明了氫氣飽和滅菌水對肥大細(xì)胞活化是有影響的。
　　3氫氣飽和滅菌水抑制了Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化。
　　本課題選用肥大細(xì)胞活化三個關(guān)鍵指標(biāo)（組

8、胺、β氨基己糖苷酶以及類胰蛋白酶），提取各組細(xì)胞上清液，通過ELISA實驗檢測各組細(xì)胞組胺、β氨基己糖苷酶以及類胰蛋白酶的ELISA水平檢測：Anti-DNP-IgE模型組中的組胺、β氨基己糖苷酶以及類胰蛋白酶水平相比正常對照組明顯升高，而氫氣飽和滅菌水治療相比Anti-DNP-IgE模型組有明顯降低。說明氫氣飽和滅菌水對于肥大細(xì)胞活化指標(biāo)具有明顯的抑制作用。
　　4形態(tài)學(xué)角度觀察氫氣飽和滅菌水對肥大細(xì)胞活化的三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激

9、酶影響。
　　免疫熒光雙重定位染色結(jié)果顯示：Anti-DNP-IgE刺激后，發(fā)現(xiàn)Syk、Lyn以及Fyn三種蛋白會發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)的重新分布，均會向細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移；而經(jīng)氫氣干預(yù)后，會抑制上述轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步從形態(tài)學(xué)說明氫氣飽和滅菌水可能通過抑制三種酪氨酸激酶通路來抑制肥大細(xì)胞活化。
　　5氫氣飽和滅菌水抑制了肥大細(xì)胞活化初始階段的三種關(guān)鍵酪氨酸蛋白激酶的激活。
　　Western blot結(jié)果顯示Anti-DNP-IgE刺激后，

10、P-SYK、P-LYN、P-FYN表達(dá)明顯增高；而經(jīng)氫氣飽和滅菌水干預(yù)后上述指標(biāo)表達(dá)明顯減少。說明氫氣飽和滅菌水可能抑制三種酪氨酸蛋白激酶的表達(dá)，從而達(dá)到對肥大細(xì)胞活化抑制的作用。
　　6氫氣飽和滅菌水抑制肥大細(xì)胞活化的下游通路PI3K-AKT分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。
　　Western blot結(jié)果顯示，相比于Anti-DNP-IgE模型組，氫氣飽和滅菌水治療組的P-PI3K以及P-AKT表達(dá)明顯減少。說明氫氣飽和滅菌水抑

11、制Anti-DNP-IgE刺激后肥大細(xì)胞活化，可能是通過抑制肥大細(xì)胞活化下游經(jīng)典通路PI3K-AKT的激活來實現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　1氫氣飽和滅菌水對Anti-DNP-IgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化具有抑制作用。
　　2氫氣飽和滅菌水抑制肥大細(xì)胞活化初始階段的三種關(guān)鍵酪氨酸激蛋白酶（Lyn、Syk、Fyn）的膜轉(zhuǎn)移以及磷酸化的過程。
　　3氫氣飽和滅菌水抑制肥大細(xì)胞活化的下游通路PI3K-AKT分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活<