1、目的：
　　糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)已成為終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的首要原因。既往認為DKD早期主要病變部位在腎小球，而腎小管間質纖維化是DKD發(fā)展到后期的病理學特征。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)腎小管間質損害程度成為反映腎功能下降嚴重程度和判斷預后最重要的指標，而腎小管上皮細胞轉分化(epithelial-to-mesenchymal trans

2、ition，EMT)則是腎小管間質纖維化的關鍵環(huán)節(jié)。
　　Klotho是一種抗衰老因子，早期DKD患者血清Klotho水平已出現(xiàn)明顯的下降，是DKD較早出現(xiàn)的生物標志物之一。Klotho可通過抑制TGF-β1/Smad3、ERK1/2信號通路，延緩DKD進展。早期生長反應蛋白-1(Early growth response protein1，Egr-1)，是一種具有鋅指結構的轉錄因子，可通過與TGF-β1、ERK1/2形成正反饋環(huán)

3、路促進腎臟纖維化。并且，已有研究表明，TGF-β1可通過激活ERK1/2信號通路促進腎臟纖維化。
　　目前關于Klotho與Egr-1在DKD發(fā)病中是否有相互作用及作用機制的研究未見報道。本研究旨在探索Klotho和Egr-1在DKD腎小管上皮細胞轉分化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)中發(fā)揮的作用，闡明在DKD進展中Klotho是否通過抑制TGF-β1/Smad3-ERK1/2信

4、號下調Egr-1發(fā)揮抗腎臟纖維化作用，為深入理解DKD發(fā)病的分子機制和尋找新的治療靶點提供理論基礎。
　　方法：
　　1、動物實驗
　　用HFD/STZ誘導C57BL/6J小鼠(n=12)制造糖尿病模型，同系正常小鼠(n=12)作為對照。成模后分別于6w、12w時留取血、尿行生化指標檢測，處死后取腎臟組織凍存于-80℃冰箱，或用4％多聚甲醛固定。PAS、Masson染色法觀察腎組織的形態(tài)結構變化，免疫組化法分析腎皮質中

5、Klotho和Egr-1表達的變化。
　　2、細胞培養(yǎng)
　　人腎小管上皮細胞株（HK2）購買于上海中國科學院細胞庫，于含1.0g/L糖的DMEM培養(yǎng)基+10％FBS中培養(yǎng)，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。每2-3天傳代一次。
　　3、細胞轉染
　　轉染前一天，細胞接種于12孔板中，轉染時要求細胞密度達到60％或80％。使用lipo3000進行瞬時轉染siRNA或質粒，siRNA轉染濃度為50nM，質粒轉染濃度為

6、1ug/ml。
　　4、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)
　　Trizol法提取組織及細胞總RNA。M-MLV逆轉錄酶試劑將RNA逆轉錄為cDNA。SYBR法進行實時熒光定量PCR反應，β-actin為內參，目的基因表達量按2-ΔΔCt方法計算得出。
　　5、Westem Blot
　　RIPA法提取組織及細胞總蛋白。配制10％的SDS-PAGE膠，每孔上樣量為20ug。電泳分離樣品蛋白，濕轉到PVDF膜上。

7、用5％脫脂奶粉或5％BSA封閉PVDF膜，一抗孵育PVDF膜，4℃搖床過夜。熒光二抗孵1h，TBST洗滌。在Odyssey近紅外成像系統(tǒng)發(fā)光顯影，Gel-Pro analyzer分析結果。
　　6、統(tǒng)計分析
　　各指標數(shù)據采用均數(shù)±標準差（(X)±SD）表示，多組數(shù)據比較采用單因素方差分析，正態(tài)分布兩樣本比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05時被認為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、Klotho與Egr-

8、1在HFD/STZ誘導的DM小鼠腎皮質中表達水平的變化研究
　　(1)與對照組相比，DM組小鼠血清Klotho水平6w時已明顯降低，12w進一降低，24h尿微量白蛋白水平6w時已明顯升高，12w時進一步升高。
　　(2)與對照組相比，DM組小鼠腎皮質中Klotho表達水平6w時已明顯降低，12w時進一步降低，Egr-1表達水平到12w時才出現(xiàn)明顯升高。
　　2、Klotho在DKD進展中對腎小管EMT的作用研究

9、　　(1)HK2細胞中Klotho的表達水平在HG、TGF-β1刺激后12h出現(xiàn)明顯下降，24h進一步降低。
　　(2)與pcDNA-Vector相比，瞬時轉染pcDNA-Klotho可抑制HG、TGF-β1誘導的HK2細胞中E-cadherin表達降低、α-SMA及FN表達升高。
　　(3)與si-Negative相比，瞬時轉染si-Klotho可使HG、TGF-β1誘導的HK2細胞中E-cadherin表達進一步降低、α

10、-SMA及FN表達進一步升高。
　　3、Egr-1在DKD進展中對腎小管EMT的作用研究
　　(1)HK2細胞中Egr-1的表達在HG、TGF-β1刺激后0.5h出現(xiàn)明顯的升高，6h回落到基線水平。
　　(2)與si-Negative相比，瞬時轉染si-Egr-1可減弱HG、TGF-β1誘導的HK2細胞中E-cadherin表達降低、α-SMA及FN表達升高。
　　(3)與pENTER-Vector相比，瞬時轉染

11、pENTER-Egr-1可使HG、TGF-β1誘導的HK2細胞中E-cadherin表達進一步降低、α-SMA及FN表達進一步升高。
　　4Klotho在DKD進展中下調Egr-1的機制研究
　　(1)與pcDNA-Vector相比，瞬時轉染pcDNA-Klotho可抑制HG、TGF-β1誘導的HK2細胞中Egr-1表達升高、p-Smad3/Smad3及(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白比值升高。
　　(2)與

12、si-Negative相比，瞬時轉染si-Klotho可使HG、TGF-β1誘導的HK2細胞中Egr-1表達進一步升高，p-Smad3/Smad3及(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白比值進一步升高，si-Klotho的上述作用可被ERK1/2抑制劑PD98059明顯減弱。
　　結論：
　　1、早期DKD小鼠腎皮質中Klotho表達明顯減少，Egr-1表達明顯增加，且Klotho表達水平的降低早期Egr-1表達水平的升

13、高。
　　2、HG、TGF-β1對HK2細胞中Klotho表達的抑制作用呈時間依賴性，Klotoh在DKD進展中對腎小管EMT具有抑制作用。
　　3、HG、TGF-β1可誘導HK2細胞中Egr-1瞬時表達，Egr-1在DKD進展中對腎小管EMT具有促進作用。
　　4、Klotho通過抑制TGF-β1/Smad3-ERK1/2信號通路下調HG、TGF-β1誘導的HK2中Egr-1的表達，這可能是Klotho在DKD進展中