1、海洋占整個(gè)地球表面積的71％，多樣性的生態(tài)環(huán)境蘊(yùn)藏著豐富的生物資源。深海熱液口是地球上一個(gè)極其惡劣的生存環(huán)境-高溫、高壓、缺氧、含有大量有毒的化學(xué)物質(zhì)，但是其中及其周圍卻存在著一個(gè)完整的生態(tài)系統(tǒng)。噬菌體被認(rèn)為是地球上最豐富的生命體，幾乎可以在地球上的每個(gè)生態(tài)環(huán)境中找到，同樣也暗示著它們?cè)谖⑸锒鄻有院蜕鷳B(tài)平衡上發(fā)揮著重要作用。嗜熱菌作為深海熱液口生態(tài)群落的初級(jí)生產(chǎn)者，是推動(dòng)營(yíng)養(yǎng)和能量循環(huán)的主要?jiǎng)恿ΑＪ删w是一類特殊群體，它們寄生在細(xì)菌體

2、內(nèi)，根據(jù)環(huán)境變化發(fā)生溶原或者裂解，從而引起宿主菌在整個(gè)生態(tài)群落中的分布。由于深海熱液口在地理分布上具有一定的獨(dú)立性，所以噬菌體與宿主的關(guān)系直接影響著整個(gè)熱液口生態(tài)群落的存在和結(jié)構(gòu)。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的噬菌體基因組信息添加到基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，這為噬菌體生物信息學(xué)研究提供了大量的數(shù)據(jù)，不僅包括噬菌體序列之間的分析，還有利于研究噬菌體群體之間的結(jié)構(gòu)組成。噬菌體的基因組雖然很小，但是卻編碼了自身復(fù)制所需的蛋白，如DNA包裝蛋白、頭

3、尾結(jié)構(gòu)蛋自、DNA復(fù)制相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、裂解相關(guān)蛋白等。通過比較基因組學(xué)，可以得到大量的基因多樣性數(shù)據(jù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因組之間存在著非常明顯的序列相似性。這些序列可以通過同源或者點(diǎn)特異性重組促進(jìn)噬菌體基因模塊發(fā)生互換；或者，通過非定向的遍及整個(gè)基因組發(fā)生非同源重組。 在本論文中，通過各種篩選培養(yǎng)基對(duì)深海熱液區(qū)樣品中的嗜熱菌和高溫噬菌體進(jìn)行了分離、純化，并得到了4株高溫噬菌體，對(duì)其中的高溫噬菌體D6E進(jìn)行了進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，

4、高溫噬菌體D6E為肌尾科病毒，有二十面體的頭部，長(zhǎng)長(zhǎng)的尾巴和尾絲。經(jīng)測(cè)序，D6E基因組有49335 bp，為雙鏈環(huán)狀DNA，可以編碼49個(gè)預(yù)測(cè)有功能的蛋白。和其它噬菌體一樣，D6E的基因排列也是成簇分布的，按功能可以分為四個(gè)部分：DNA包裝和頭部裝配、尾部組成、溶原與裂解、DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，D6E的大部分結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白與已知噬菌體蛋白的同源性非常低，但是溶原和裂解相關(guān)基因以及DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因

5、的核苷酸序列與本實(shí)驗(yàn)室另外一株已測(cè)序的高溫噬菌體GVE2不管在基因排列、還是這些基因編碼的氨基酸序列上都具有非常高的相似性。采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)D6E病毒粒子的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析，結(jié)果得到了10個(gè)與結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白，包括核衣殼蛋白、入口蛋白、支架蛋白等，其中質(zhì)譜匹配率非常高的兩個(gè)未知蛋白ORF3(第3條帶)和ORF16(第9條帶)的功能有待進(jìn)一步研究。 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的深海嗜熱菌噬菌體GVE2基因組測(cè)序結(jié)果和預(yù)測(cè)閱讀框分析

6、，重組表達(dá)并純化了20個(gè)GVE2蛋白，制備相應(yīng)的多克隆抗體，采用Western Blot對(duì)噬菌體的基因表達(dá)進(jìn)行了分析。通過免疫共沉淀(Co-IP)和GST下拉(GST pull-down)試驗(yàn)尋找在感染過程中GVE2與宿主可能發(fā)生相互作用的蛋白。通過實(shí)驗(yàn)，得到了兩種蛋白復(fù)合體：與GVE2 ORF5(核衣殼蛋白，VP371蛋白)相互作用的分子伴侶蛋白；與GV2 ORF36相互作用的未知蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)宿主的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和分子

7、伴侶蛋白參與了噬菌體的感染過程，因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步研究噬菌體GVE2 VP371蛋白與宿主天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和分子伴侶形成的蛋白復(fù)合體在噬菌體感染中的作用。Western blot和細(xì)菌雙雜交試驗(yàn)結(jié)果顯示，VP371蛋白和分子伴侶蛋白之間、分子伴侶蛋白和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶之間存在相互作用，而VP371蛋白和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶之間沒有相互作用，復(fù)合體中3個(gè)蛋白呈串聯(lián)結(jié)構(gòu)結(jié)合在一起。在噬菌體感染實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，隨著感染時(shí)間的增加，VP371的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量

8、逐漸增大，同時(shí)分子伴侶蛋白和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶都比未感染時(shí)有了明顯上調(diào)表達(dá)。因此，在噬菌體感染過程中，GVE2核衣殼蛋白VP371和宿主的分子伴侶蛋白發(fā)生相互作用，并依次遞進(jìn)促進(jìn)了分子伴侶蛋白和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的上調(diào)表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)控了宿主細(xì)胞的代謝活動(dòng)。 本論文對(duì)對(duì)高溫噬菌體GVE2的ORF3(入口蛋白)和ORF56(胸腺嘧啶合成酶)進(jìn)行了功能鑒定。ORF3預(yù)測(cè)為噬菌體入口蛋白，雖然在氨基酸序列上它與其他噬菌體具有很低的同源性，但

9、與SPP1、HK97的入口蛋白都具有相似的螺旋/折疊排列結(jié)構(gòu)，屬于HK97入口蛋白家族，在DNA包裝過程中發(fā)揮著相同的功能。預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，GVE2同SPP1和Phi29都具有非常保守的α-Helices，可能是在基因組包裝過程中保留下來的一種古老結(jié)構(gòu)域。通過免疫電鏡定位，結(jié)果表明入口蛋白位于頭尾的連接處。Orf56編碼原核型的胸腺嘧啶合成酶，與已知的不同物種的胸腺嘧啶合成酶有很高的相似性。ORF56中可以找到符合胸腺嘧啶合成酶的