1、腫瘤組織以快速增長(zhǎng)為其基本特征，因此與正常組織相比，腫瘤組織需要大量的新生血管為它提供營(yíng)養(yǎng)。但是腫瘤的新生血管往往結(jié)構(gòu)紊亂且功能不全，新生血管的生長(zhǎng)速度也遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上腫瘤生長(zhǎng)的需要。因此，腫瘤組織離血管較遠(yuǎn)的部分存在于低葡萄糖的環(huán)境中，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)腸癌和胃癌組織中心的葡萄糖濃度分別僅有0.12和0.4mM。但是處在缺乏葡萄糖環(huán)境中的腫瘤組織依然能夠生存。在體內(nèi)，腫瘤能夠調(diào)節(jié)自己適應(yīng)葡萄糖缺乏的環(huán)境，但是在體外培養(yǎng)的環(huán)境中腫瘤細(xì)胞缺乏

2、葡萄糖供給時(shí)則無(wú)法生存。腫瘤在體內(nèi)是如何適應(yīng)葡萄糖缺乏的環(huán)境，以等待血管新生獲得能量，這一問(wèn)題的深入研究對(duì)于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)理顯得尤為重要。
　　Otto Warburg首先觀察到即使在氧氣充足的環(huán)境中，腫瘤仍然傾向于利用糖酵解途徑作為分解葡萄糖的主要方式。腫瘤這種特殊的代謝方式的轉(zhuǎn)換，就導(dǎo)致了糖酵解的產(chǎn)物乳酸的積聚。已有一些研究報(bào)道:在人宮頸癌、頭頸部腫瘤、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌中乳酸水平升高與較高的轉(zhuǎn)移率和較差的臨床預(yù)后相關(guān)。

3、一些研究指出乳酸可以被腫瘤細(xì)胞利用，通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，從而為腫瘤細(xì)胞供能。乳酸也可以作為信號(hào)分子發(fā)揮作用，例如促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF，它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和刺激血管生成。乳酸還可以抑制活化的T細(xì)胞，幫助腫瘤細(xì)胞完成免疫逃逸。
　　在實(shí)體腫瘤中，同時(shí)存在這樣的情況:一方面，血管的發(fā)育生長(zhǎng)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上腫瘤的快速生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)存在葡萄糖缺乏區(qū)域;另一方面，在周邊血管豐富的區(qū)域，葡萄糖供給充足，腫瘤細(xì)胞通過(guò)有氧糖酵解產(chǎn)生

4、了大量的乳酸。這些乳酸分泌到細(xì)胞之間，對(duì)于缺少葡萄糖供給的腫瘤組織有重要病理生理作用。本研究將從體外培養(yǎng)中從細(xì)胞水平驗(yàn)證乳酸對(duì)于腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)葡萄糖缺乏的作用，并探討乳酸是如何調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)葡萄糖缺乏，進(jìn)一步從分子水平揭示乳酸調(diào)節(jié)的可能信號(hào)通路，并從動(dòng)物模型中驗(yàn)證我們的結(jié)果。本研究有助于揭示乳酸參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為預(yù)測(cè)和治療腫瘤提供了新靶標(biāo)。
　　第一部分乳酸維持腫瘤細(xì)胞在葡萄糖缺乏中生存
　　為了探究乳酸在腫瘤細(xì)胞抵抗

5、葡萄糖饑餓中的作用，我們首先在無(wú)糖完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，并添加不同濃度的乳酸。發(fā)現(xiàn)添加乳酸能夠顯著延長(zhǎng)A549細(xì)胞在無(wú)糖培養(yǎng)基的存活時(shí)間。其中在乳酸濃度為20mM的無(wú)糖培養(yǎng)環(huán)境中A549細(xì)胞的生存時(shí)間最長(zhǎng)。對(duì)于其他四種腫瘤細(xì)胞系也具有同樣的效果，表明乳酸能夠幫助腫瘤細(xì)胞在葡萄糖缺乏的環(huán)境中生存。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性乳酸也具有同樣的作用，并且乳酸的作用需要?dú)潆x子與乳酸根離子共同參與。
　　接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中為了證實(shí)

6、在無(wú)糖環(huán)境中乳酸是否是作為能量底物為腫瘤細(xì)胞提供能量，我們發(fā)現(xiàn)同樣濃度的丙酮酸并不能如乳酸一樣延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中的生存時(shí)間，而且采用Seahorse Bioscience XF24生物能量檢測(cè)儀檢測(cè)添加乳酸前后腫瘤細(xì)胞的氧氣消耗并沒(méi)有明顯的變化，在培養(yǎng)基中添加的乳酸在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過(guò)程中也沒(méi)有出現(xiàn)明顯的消耗，采用干擾RNA技術(shù)下調(diào)乳酸進(jìn)入細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體MCT1和MCT4也沒(méi)有明顯影響乳酸的作用。在乳酸的調(diào)節(jié)下，無(wú)糖環(huán)境中A549細(xì)

7、胞的糖酵解、有氧糖代謝、磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶基因表達(dá)均出現(xiàn)了降低。與乳酸相比，2-DG（糖酵解抑制劑）和魚(yú)藤酮（有氧呼吸抑制劑）在無(wú)糖環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞生存時(shí)間的延長(zhǎng)作用要小得多。因此，乳酸確實(shí)在無(wú)糖環(huán)境中降低了腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平，但是其調(diào)節(jié)程度并不足以解釋乳酸長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中生存的作用。
　　進(jìn)一步，我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳酸的參與下無(wú)糖環(huán)境中A549細(xì)胞的凋亡比例明顯下降，這種明顯的凋亡

8、減少使得腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境下長(zhǎng)期生存。
　　第二部分乳酸通過(guò)Bcl-2途徑抵抗腫瘤細(xì)胞因葡萄糖缺乏引起的凋亡
　　在第一部分的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)乳酸對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株的作用有差異，對(duì)DU145、A549和H1299細(xì)胞株的增殖速度和生存時(shí)間明顯大于PC3和U87-MG細(xì)胞株，據(jù)此將腫瘤細(xì)胞株分乳酸敏度組和不敏感組。在比較了上述二組細(xì)胞株的遺傳學(xué)背景之后，我們通過(guò)Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與乳酸敏感組的細(xì)胞株相比，乳酸不敏感

9、組的PC3和U87-MG的AKT磷酸化增多。接著我們分別使用了AKT抑制劑哌立福新和激活劑胰島素樣生長(zhǎng)因子1，證實(shí)乳酸可以活化AKT。
　　為進(jìn)一步揭示乳酸活化AKT抗凋亡的具體信號(hào)傳過(guò)通路，我們對(duì)ATK的上下游分子分別作了篩查驗(yàn)證。首先，通過(guò)使用PI3K抑制劑證實(shí)乳酸能夠通過(guò)PI3K顯著并迅速的引起AKT在蘇氨酸308位點(diǎn)和絲氨酸473位點(diǎn)的磷酸化從而將其活化。然后，通過(guò)Western blot， RNA干擾技術(shù)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)

10、技術(shù)，我們證實(shí)了乳酸可通過(guò)上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)抵抗腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中的細(xì)胞凋亡，并且證實(shí)Bcl-2上調(diào)與mTOR活化有關(guān)。最后，通過(guò)檢測(cè)線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C情況和Caspase9的活性，證實(shí)乳酸上調(diào)Bcl-2通過(guò)抑制細(xì)胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase9凋亡途徑從而抵抗腫瘤細(xì)胞的凋亡。至此，我們發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路在乳酸抵抗腫瘤細(xì)胞因葡萄糖缺乏引起凋亡過(guò)程的確切機(jī)制。
　　

11、第三部分乳酸在腫瘤適應(yīng)葡萄糖缺乏中作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究
　　為驗(yàn)證我們?cè)隗w外發(fā)現(xiàn)的乳酸促腫瘤生存現(xiàn)象和PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路參與的抗凋亡機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了乳酸作用荷瘤裸鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型，在瘤周皮下注射乳酸和生理鹽水處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)，減少荷瘤鼠的生存期，減少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤壞死。
　　TUNEL和Caspase3/7檢測(cè)證實(shí)乳酸減少裸鼠A5

12、49肺癌皮下移植瘤凋亡。移植瘤的病理切片進(jìn)行免疫組化染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸組與生理鹽水組相比，Phospho-AKT(Thr308), Phospho-AKT(Ser473), Bcl-2和Phospho-mTOR(Ser2448)的表達(dá)均增多，證實(shí)乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤內(nèi)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路活化。
　　結(jié)論
　　1.乳酸能夠維持腫瘤細(xì)胞在無(wú)糖環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間生存，其功能與內(nèi)源性乳酸相似，是

13、由氫離子與乳酸根離子共同的效果。乳酸并不直接為腫瘤細(xì)胞提供能量，但降低了腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平。在無(wú)糖環(huán)境中乳酸主要通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)維持其生存。
　　2.乳酸通過(guò)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞減少因葡萄糖缺乏引起的細(xì)胞凋亡，乳酸通過(guò)上調(diào)Bcl-2抑制細(xì)胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase-9凋亡途徑。
　　3.乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)，減少荷瘤鼠的生存期，減少裸鼠A5

14、49肺癌皮下移植瘤壞死和凋亡。乳酸促進(jìn)裸鼠A549肺癌皮下移植瘤內(nèi)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號(hào)通路活化。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.發(fā)現(xiàn)并證實(shí)乳酸參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為預(yù)測(cè)和治療腫瘤提供了新靶標(biāo)。
　　2.發(fā)現(xiàn)并證實(shí)在無(wú)糖環(huán)境中乳酸并不直接為腫瘤細(xì)胞提供能量，乳酸通過(guò)降低腫瘤細(xì)胞的糖代謝水平，減少腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)維持其生存。
　　3.初步揭示了乳酸促腫瘤生存作用的分子機(jī)制。乳酸通過(guò)PI3K/AKT/mTO