1、目的:
　　本研究從在體實驗方面展開，通過建立腎虛大鼠模型并用補腎治法進行干預，從動物行為學、組織形態(tài)學和分子生物學等多角度多層面，觀察腎虛大鼠海馬神經(jīng)干細胞的增殖變化情況和補腎治法的干預作用，探討腎主藏精的功能與海馬神經(jīng)干細胞增殖的內(nèi)在關系，以及補腎治法對神經(jīng)干細胞增殖分化作用機制，并為中醫(yī)藥結合現(xiàn)代干細胞技術在治療臨床重大疑難疾病提供理論與實驗依據(jù)。
　　方法:
　　一、理論研究
　　通過對相關文獻的梳理，討

2、論中醫(yī)腎主藏精與干細胞的增殖分化的關系及影響神經(jīng)干細胞增殖分化的因素。
　　二、實驗研究
　　采用單純房室不節(jié)（雌雄比例5∶1合籠30天）、長期房室不節(jié)（雌雄比例2∶1合籠6個月）、“房室不節(jié)，勞倦過度”（雌雄比例5∶1合籠，并結合1小時強迫游泳，30天）及灌胃腺嘌呤不同造模方法制備腎虛大鼠模型。通過觀察Morris水迷宮實驗及組織形態(tài)學等指標變化，評價不同造模方法制備的腎虛大鼠模型質(zhì)量，為進一步研究提供理想的腎虛動物模型。

3、觀察補腎治法對腎虛模型大鼠的空間學習記憶能力及海馬組織形態(tài)學的影響;補腎治法對腎虛模型大鼠海馬DG區(qū)細胞超微結構及增殖凋亡相關蛋白表達的影響;補腎治法對腎虛模型大鼠海馬DG區(qū)細胞β-catenin、Wnt1、CyclinD1和c-Myc表達的影響。
　　結果:
　　一、理論研究
　　中醫(yī)腎主藏精與干細胞的增殖分化存在相關性，補腎方藥對干細胞的增殖和分化均有一定的干預效應。
　　二、實驗研究
　?。ㄒ唬┭a腎治

4、法對單純房室不節(jié)腎虛大鼠的空間學習記憶能力的影響
　　Morris水迷宮定位航行實驗中，組間兩兩比較，與正常對照組比較，腎虛模型組潛伏期明顯延長(P＜0.01，P＜0.05);與腎虛模型組比較，艾灸腎俞穴組潛伏期明顯縮短（P＜0.05）;與艾灸腎俞穴組比較，六味地黃丸低劑量組和六味地黃丸高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P＜0.01，P＜0.05)?？臻g探索實驗中，大鼠入水后前20s，與正常對照組相比，腎虛模型組穿越原平臺區(qū)域次數(shù)和

5、平臺周圍區(qū)域一時間均有所減少，但無統(tǒng)計學意義;與腎虛模型組比較，六味地黃丸高劑量組大鼠穿越原平臺區(qū)域次數(shù)明顯提高（P＜0.05），艾灸腎俞穴組雖有所增長，但差異無統(tǒng)計學意義，六味地黃丸高劑量組和艾灸腎俞穴組大鼠平臺周圍區(qū)域一時間均明顯提高（P＜0.05）;與六味地黃丸低劑量組比較，六味地黃丸高劑量組和艾灸腎俞穴組穿越原平臺區(qū)域次數(shù)和平臺周圍區(qū)域一時間明顯延長(P＜0.01，P＜0.05)。
　?。ǘ┭a腎治法對長期房室不節(jié)腎虛大鼠

6、海馬DG區(qū)細胞生長變化的影響1.Morris水迷宮實驗結果
　　定位航行實驗中與正常對照組比較，腎虛模型組潛伏期明顯延長（P＜0.01）;與腎虛模型組比較，其余各干預組潛伏期明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05);各干預組間無顯著性差異?？臻g探索實驗中，入水后20s和60s內(nèi)，與正常對照組相比，腎虛模型組原平臺所在象限停留時間和平臺周邊區(qū)域一停留時間明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);與腎虛模型組相比，金匱腎氣丸高劑量組平臺所

7、在象限停留時間和平臺周邊區(qū)域一停留時間明顯增加（P＜0.05）。入水后60s內(nèi)，六味地黃丸低劑量組平臺周邊區(qū)域一停留時間明顯增加（P＜0.05）;與金匱腎氣丸高劑量組相比，金匱腎氣丸低劑量組和艾灸腎俞穴組平臺周邊區(qū)域一停留時間明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)。
　　2.各組大鼠海馬DG區(qū)細胞超微結構變化電鏡檢測結果
　　腎虛模型組大鼠海馬DG區(qū)發(fā)生細胞超微結構損傷，主要表現(xiàn)為神經(jīng)微絲和微管結構有明顯的溶解，線粒體發(fā)生明

8、顯的空泡變性。各干預組海馬DG區(qū)發(fā)生細胞超微結構損傷不同程度的減輕。其中，以金匱腎氣丸高劑量組情況最佳。
　　3.各組大鼠海馬DG區(qū)免疫組織化學檢測結果
　　與正常對照組比較，腎虛模型組大鼠海馬DG區(qū)細胞β-catenin、NeuN、PCNA表達均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05)，TUNEL表達均明顯增加，與腎虛模型組比較，艾灸腎俞穴組大鼠海馬DG區(qū)細胞NeuN、PCNA表達均明顯增加（P＜0.05），其余各用藥組大鼠

9、海馬DG區(qū)細胞β-catenin、NeuN、PCNA表達均明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，TUNEL表達均明顯減少(P＜0.01，P＜0.05);高劑量組療效優(yōu)于低劑量組，藥物組療效優(yōu)于艾灸組。
　　（三）補腎治法對“房室不節(jié)，勞倦過度”腎虛大鼠海馬DG區(qū)細胞生長變化的影響1.Morris水迷宮實驗結果
　　定位航行實驗中，與正常對照組比較，腺嘌呤組和腎虛模型組潛伏期明顯延長(P＜0.01);與腎虛模型組比較，六味地

10、黃丸組和金匱腎氣丸組潛伏期明顯縮短（P＜0.01，P＜0.05）;與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組潛伏期明顯縮短（P＜0.05）;與六味地黃丸組比較，金匱腎氣丸組潛伏期差異，無統(tǒng)計學意義。空間探索實驗中，與正常對照組相比，腺嘌呤組和腎虛模型組大鼠站臺穿越次數(shù)、平臺周邊區(qū)域一停留時間和路程明顯減少(P＜0.01);與腎虛模型組相比，金匱腎氣丸組大鼠站臺穿越次數(shù)、平臺周邊區(qū)域一停留時間和路程明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，六味地黃丸組大

11、鼠站臺穿越次數(shù)和路程明顯增加（P＜0.05）;與腺嘌呤組相比，腺嘌呤加藥組站臺穿越次數(shù)、平臺周邊區(qū)域一停留時間和路程明顯增加（P＜0.05）。
　　2.各組大鼠腎、睪丸組織形態(tài)學改變
　　腎虛模型組和腺嘌呤組大鼠腎臟和睪丸存在明顯的組織形態(tài)學損傷。腎虛模型組可見腎皮質(zhì)中腎小管中可見明顯紅染的透明管型，間質(zhì)血管充血明顯，局部有明顯的炎性病變，周圍有炎性細胞浸潤。腺嘌呤組大鼠腎臟存在更嚴重的組織形態(tài)學損傷，主要表現(xiàn)為腎單位明顯減

12、少，腎小管擴張呈網(wǎng)狀，腎小管上皮細胞變成扁平狀，有些腎小管中可見膿液，里面含有炎性細胞和壞死的細胞碎片，間質(zhì)中可見明顯的炎性細胞浸潤。各干預組腎臟的組織形態(tài)學損傷均有不同程度的減輕。腎虛模型組和腺嘌呤組大鼠睪丸曲精細管明顯的萎縮，腔內(nèi)生精細胞明顯減少，甚至壞死。各干預組睪丸的組織形態(tài)學損傷均有不同程度的減輕。
　　3.各組大鼠腎、睪丸免疫組織化學檢測結果
　　各組大鼠睪丸免疫組織化學檢測結果可見，與正常對照組比較，腎虛模型組

13、和腺嘌呤組大鼠睪丸細胞β-catenin表達明顯減少(P＜0.01)，PCNA表達雖有減少，但差異無統(tǒng)計學意義，TUNEL表達均明顯增加（P＜0.01）;與腎虛模型組比較，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組大鼠睪丸細胞β-catenin和PCNA表達均明顯增加（P＜0.01），TUNEL表達均明顯減少(P＜0.01);與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組大鼠睪丸細胞β-catenin表達明顯增加（P＜0.01），PCNA表達雖有增加，但差異無統(tǒng)計學意義

14、，TUNEL表達均明顯減少（P＜0.01）;與六味地黃丸組比較，金匱腎氣丸組各項表達差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　各組大鼠腎臟免疫組織化學檢測結果可見，與正常對照組比較，腺嘌呤組大鼠腎臟PCNA表達明顯減少(P＜0.01)，β-catenin表達雖有減少，但差異無統(tǒng)計學意義，腎虛模型組和腺嘌呤組TUNEL表達均明顯增加(P＜0.01);與腎虛模型組比較，六味地黃丸組β-catenin表達均明顯增加(P＜0.01)，金匱腎

15、氣丸組雖有增加，但差異無統(tǒng)計學意義，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組TUNEL表達均明顯減少(P＜0.01);與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組大鼠腎臟β-catenin和表達明顯增加(P＜0.01)，TUNEL表達均明顯減少(P＜0.01)。
　?。ㄋ模┭a腎法對腎虛大鼠海馬DG區(qū)細胞Wnt信號通路相關蛋白的影響
　　1.各組海馬DG區(qū)組織Western-blotting結果
　　與正常對照組比較，腎虛模型組和腺嘌呤組Wnt1、β

16、-catenin、c-Myc及CyclinD1蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）;與腎虛模型組比較，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組Wnt1、β-catenin、c-Myc及CyclinD1蛋白相對表達明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，與腺嘌呤組比較，腺嘌呤加藥組Wnt1、β-catenin、c-Myc及CyclinD1蛋白相對表達明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。
　　2.各組海馬DG區(qū)Real-time PCR檢測結

17、果
　　與正常對照組比較，腎虛模型組和腺嘌呤組β-catenin mRNA、CyclinD1 mRNA和c-Myc mRNA相對表達量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），Wnt1 mRNA相對表達量雖有降低，但無統(tǒng)計學差異;與腎虛模型組比較，六味地黃丸組和金匱腎氣丸組Wnt1mRNA、β-catenin mRNA、c-Myc mRNA及CyclinD1 mRNA相對表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）;與腺嘌呤組比較，腺

18、嘌呤加藥組β-catenin mRNA、c-Myc mRNA及CyclinD1mRNA相對表達明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。
　　結論:
　?。ㄒ唬╅L期房室不節(jié)、房室不節(jié)結合勞倦過度及灌胃腺嘌呤均可制作理想的腎虛大鼠模型，今后可以根據(jù)實驗操作需要和研究重心的不同，進行選擇。
　?。ǘ┭a腎治法可改善腎虛大鼠空間學習記憶障礙、海馬DG區(qū)細胞超微結構及組織形態(tài)學病變。
　?。ㄈ┭a腎方藥促進腎虛大鼠海馬DG

19、區(qū)神經(jīng)干細胞增殖，其作用機制可能是上調(diào)腎虛大鼠海馬DG區(qū)細胞Wnt1表達，激活經(jīng)典Wnt信號通路，導致胞內(nèi)β-catenin大量聚集，上調(diào)下游靶基因c-Myc和CyclinD1表達，啟動靶基因轉(zhuǎn)錄，促進海馬神經(jīng)干細胞增殖。
　?。ㄋ模┲嗅t(yī)腎精與海馬神經(jīng)干細胞可能存在某種程度上的聯(lián)系，腎主藏精的功能體現(xiàn)在促進干細胞的增殖，補腎治法可能通過激活經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)控干細胞的增殖。
　　創(chuàng)新點:
　?。ㄒ唬┨岢鲂碌募僬f: