1、目的：
　　本課題擬通過分子病理及分子生物學方法，結(jié)合體內(nèi)外研究，全方位闡明S100A11促進結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的作用，提供LASP1調(diào)控S100A11發(fā)揮生物學功能的直接證據(jù)，多方面實驗論證了經(jīng)典的TGFβ/Smad信號通路通過LASP1-S100A11軸誘導結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，為確立TGFβ-LASP1-S100A11軸作為晚期結(jié)直腸癌患者臨床治療靶點提供充分的科學依據(jù)。
　　方法：
　　1、分析結(jié)直腸癌組織中LASP1和

2、S100A11表達的相關性，細胞內(nèi)導入外源性LASP1后檢測S100A11蛋白及mRNA的表達，激光免疫共聚焦、免疫共沉淀等方法檢測LASP1與S100A11蛋白水平的相互作用;
　　2、TGFβ處理細胞從形態(tài)學及分子表型觀察其誘導EMT發(fā)生，檢測下游蛋白LASP1、S100A11的表達及Smad信號通路的激活，沉默LASP1、S100A11的表達，探討其在TGFβ介導EMT過程中的關鍵作用;
　　3、免疫組織化學檢測臨床結(jié)

3、直腸癌組織樣本中S100A11的表達，冰凍切片免疫熒光觀察S100A11亞細胞定位，分析S100A11不同的亞細胞定位表達與臨床病理學參數(shù)及預后的關系;
　　4、引入核定位和核輸出信號改造S100A11重組載體，構(gòu)建不同亞細胞定位的過表達S100A11細胞系，RNA干擾技術(shù)沉默S100A11的表達，從體外水平觀察結(jié)直腸癌細胞生物學行為的影響，探討其在EMT發(fā)生過程中的作用;
　　5、構(gòu)建不同亞細胞定位的穩(wěn)定過表達S100A1

4、1細胞系，免疫印跡和免疫熒光鑒定穩(wěn)定株構(gòu)建成功，從體內(nèi)外水平觀察結(jié)直腸癌細胞生物學行為的影響，探討其在EMT發(fā)生過程中的作用;
　　6、利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)，篩選并構(gòu)建S100A11胞漿內(nèi)相互作用的信號分子及在細胞核內(nèi)相互作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，合成特異性siRNA，探討其對腫瘤生物學行為及信號通路的作用，敲除候選靶蛋白的表達分析其在TGFβ-LASP1-S100A11介導的生物學功能中的作用，明確S100A11胞漿和胞核水

5、平的雙重調(diào)控機制在腫瘤惡性生物學行為中的作用;
　　統(tǒng)計學分析:
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，定量數(shù)據(jù)為3次獨立實驗結(jié)果匯總用均數(shù)±標準誤表示。S100A11與臨床病理學參數(shù)之間關系用Pearson'schi-squared（x2）檢驗;Kaplan-Meier生存曲線用來統(tǒng)計S100A11單因素變量預后相關分析，多因素變量分析用Cox比例風險回歸。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：<

6、br>　　1.LASP1在蛋白水平通過蛋白質(zhì)相互作用正向調(diào)節(jié)S100A11的表達
　　1.1 LASP1正向調(diào)節(jié)S100A11蛋白水平的表達
　　1.2分析LASP1和S100A11的相互作用
　　2.LASP1通過S100A11介導結(jié)直腸癌細胞的侵襲性表型和EMT
　　2.1LASP1通過S100A11介導結(jié)直腸癌細胞的侵襲性表型
　　2.2LASP1通過S100A11介導結(jié)直腸癌細胞的EMT
　　

7、2.3S100A11參與TGFβ介導的EMT發(fā)生
　　3.胞漿胞核中S100A11在結(jié)直腸癌中的表達及其臨床意義
　　3.1結(jié)直腸癌組織中S100A11的表達
　　3.2結(jié)直腸癌細胞中S100A11的表達
　　3.3S100A11的表達水平與患者臨床預后的相關性分析
　　Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，核、漿中S100A11過表達的結(jié)直腸癌患者總體生存率顯著低于低表達組，統(tǒng)計學上有顯著差異(P＜0

8、.05)。
　　3.4影響CRC患者預后的單因素與多因素分析
　　單因素分析提示核、漿中S100A11過表達與結(jié)直腸癌患者臨床預后相關，然而，目前多因素逐步回歸分析的研究結(jié)果尚不支持將胞漿、胞核S100A11過表達作為預測患者不良預后的獨立指標(P＞0.05)。
　　4.體外胞漿胞核中分別過表達S100A11促進結(jié)直腸癌細胞的侵襲性表型并誘導EMT
　　4.1瞬時過表達S100A11對結(jié)直腸癌細胞增殖遷移和劃痕愈

9、合能力的影響
　?、賁100A11瞬時過表達效果驗證
　?、赟100A11瞬時過表達對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響
　?、跾100A11瞬時過表達對結(jié)直腸癌細胞遷移能力的影響
　　Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，在SW480和HCT116細胞中，瞬時過表達S100A11的細胞株與對照組(HA)相比細胞遷移的數(shù)量明顯增多。
　?、躍100A11瞬時過表達對結(jié)直腸癌細胞劃痕愈合能力的影響
　　劃痕實

10、驗結(jié)果顯示，瞬時過表達S100A11的細胞株與對照組(HA)相比遷移率明顯增加(P＜0.05)。
　　4.2 S100A11瞬時沉默對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲，劃痕愈合能力的影響
　?、賁100A11瞬時沉默效率驗證
　?、赟100A11瞬時沉默對結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響
　　③S100A11瞬時沉默對結(jié)直腸癌細胞遷移能力的影響
　?、躍100A11瞬時沉默對結(jié)直腸癌細胞劃痕愈合能力的影響
　　4.3

11、 S100A11調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制
　　5.體內(nèi)胞漿胞核中分別過表達S100A11可促進結(jié)直腸癌細胞的成瘤能力和肺內(nèi)定植能力
　　5.1穩(wěn)定過表達S100A11結(jié)直腸癌細胞株SW480的構(gòu)建與鑒定
　　5.2 S100A11穩(wěn)定過表達體外實驗
　　5.3 S100A11穩(wěn)定過表達體內(nèi)實驗
　　6.S100A11調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移分子機制的初步探討
　　6.1S100A11相互作用蛋白的篩選

12、>　　采用帶HA標簽抗體的Agarose親和帶HA標簽的S100A11融合蛋白，結(jié)合的總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離。實驗組為SW480/HA-NES-S100A11、SW480/HA-NLS-S100A11、SW480/HA-S100A11，對照組為SW480/HA。
　　6.2Flotillin-1、Histone h1t的生物學功能
　　構(gòu)建Flotillin-1、Histone h1t過表達載體，合成特異性siRN

13、A。Transwell實驗表明在HCT116細胞中過表達Flotillin-1、Histone h1t后，結(jié)直腸癌細胞侵襲能力明顯增強，且TGFβ/Smad經(jīng)典信號通路被激活;在HCT116細胞中干擾Flotillin-1、Histone h1t后，結(jié)直腸癌細胞侵襲能力明顯減弱，且TGFβ/Smad經(jīng)典信號通路被抑制。
　　6.3Flotillin-1、Histone h1t通過TGFβ/LASP1/S100A11軸誘導結(jié)直腸癌E

14、MT
　　為了明確S100A11胞漿中Flotillin-1、胞核中Histone h1t分別介導的分子機制，我們進行了如下的恢復實驗。設立Control、S100A11、S100A11+si-Histoneh1t組和Control、S100A11、S100A11+si-Flotillin-1、TGFβ+ si-Flotillin-1、 LASP1+si-Flotillin-1組，Transwell和Western Blot實驗結(jié)

15、果均表明干擾掉Flotillin-1、Histone h1t后可中和TGFβ/LASP1/S100A11軸介導的遷移能力(P＜0.05)和EMT的能力。
　　結(jié)論：
　　1.結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關蛋白LASP1正向調(diào)節(jié)S100A11的蛋白表達，且LASP1和S100A11存在蛋白質(zhì)相互作用
　　2.LASP1通過S100A11介導結(jié)直腸癌細胞的侵襲性表型和EMT
　　3.結(jié)直腸癌組織和細胞中，胞漿胞核S100A11均有

16、表達，且表達均明顯上調(diào)，與結(jié)直腸癌患者不良預后相關;
　　4.體外實驗表明，亞細胞定位的外源性S100A11過表達后，促進結(jié)直腸癌的增殖遷移和劃痕愈合能力并誘導EMT;干擾S100A11后，明顯抑制結(jié)直腸癌的增殖遷移和劃痕愈合能力并抑制EMT;
　　5.體內(nèi)試驗表明，亞細胞定位的內(nèi)源性S100A11的過表達可促進結(jié)直腸癌的成瘤能力和肺定植能力;
　　6.S100A11下游靶蛋白胞漿中信號分子Flotllin-1、胞核中